發(fā)布時間：2023-08-01 19:45

　　在過去的幾十年內,由于生活方式的巨大變化,非酒精性脂肪肝炎(NASH)已成為目前全球最為常見的慢性肝臟疾病。NASH正迅速成為肝臟移植以及肝癌(HCC)的重要誘因,也是心血管疾病(CVDs)的高危因素。NASH發(fā)病率的急劇持續(xù)增長給個人及社會都造成巨大的經濟負擔。由于缺乏有效的藥物治療,NASH造成的社會負擔將會繼續(xù)攀升,迫切需要在分子機制和藥物研發(fā)方面開展研究。在所有NASH患者中,不同個體的致病因素因其所處地域或種族的不同存在很大差異,NASH發(fā)生發(fā)展期間的復雜機制無疑給研發(fā)NASH有效治療手段帶來了巨大挑戰(zhàn)。凋亡信號調節(jié)激酶1(ASK1)是絲裂原活化蛋白3激酶家族的成員,它是NASH發(fā)生中一個重要的激活因子。在代謝應激下,ASK1的持續(xù)性激活能夠通過JNK1/2-p38信號通路促進肝臟炎癥和纖維化進展。因此,抑制ASK1的活化已成為NASH治療藥物開發(fā)的主要靶點。多年研究發(fā)現,ASK1抑制劑GS4997可以通過非選擇性抑制ASK1磷酸化激活對NASH發(fā)揮治療作用,然而其III期臨床治療效果并不理想。我們推斷,在保持其正常功能情況下,ASK1活性的最優(yōu)調控有望成為NASH治療的靶點...

【文章頁數】：137 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
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第一章 前言
    1 非酒精性脂肪肝研究進展
        1.1 流行病學
        1.2 發(fā)病機制
            1.2.1 脂肪酸的合成與降解
            1.2.2 胰島素抵抗(IR)
            1.2.3 氧化應激
            1.2.4 代謝綜合征
            1.2.5 纖維化
                1.2.5.1 肝臟纖維化的機制
                1.2.5.2 肝細胞對HSCs活化的調控作用
            1.2.6 微生物
        1.3 NASH治療方案及臨床研究進展
            1.3.1 代謝靶點相關藥物
                1.3.1.1 法尼酯 X 受體(FXR)激動劑
                1.3.1.2 過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)激動劑
                1.3.1.3 FGF19和FGF21 類似物
                1.3.1.4 乙酰輔酶 A 羧化酶(ACC)抑制劑和硬脂酰輔酶 A 去飽和酶-1(SCD-1)抑制劑
                1.3.1.5 甲狀腺激素受體-β(THR-β)激動劑
            1.3.2 細胞應激、凋亡及纖維化靶點相關藥物
                1.3.2.1 泛半胱天冬酶(pan-caspase)抑制劑
                1.3.2.2 細胞凋亡信號調節(jié)激酶 1(ASK1)抑制劑
                1.3.2.3 半乳糖凝集素-3(Galectin-3)抑制劑
                1.3.2.4 賴氨酰氧化酶樣 2(LOXL2)抗體
            1.3.3 CCR2和CCR5 拮抗劑
            1.3.4 聯合治療
    2 凋亡信號調節(jié)激酶 1(ASK1)
        2.1 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路
        2.2 ASK家族及分子結構
        2.3 ASK1 活性調控機制
            2.3.1 ASK1 二聚化
                2.3.1.1 Trx
                2.3.1.2 TRAF家族
                2.3.1.3ASK2
            2.3.2 翻譯后修飾(PTMs)調控
                2.3.2.1 磷酸化修飾
                2.3.2.2 泛素化修飾
            2.3.3 轉錄調控
        2.4 應激下的ASK1
            2.4.1 氧化應激
            2.4.2 內質網(ER)應激
        2.5 ASK1 參與調控天然免疫反應
        2.6 ASK1 相關疾病
    3 TRAFS家族成員
        3.1 TRAFs分子的結構與功能
        3.2 TRAFs參與信號通路轉導
            3.2.1 TRAFs與 TNF-R信號通路
            3.2.2 TRAFs與 TLR信號通路
        3.3 TRAFs與人類疾病
            3.3.1 TRAFs敲除小鼠模型
            3.3.2 TRAFs與動脈粥樣硬化
            3.3.3 TRAFs與心肌肥厚
            3.3.4 TRAFs與肝臟糖代謝
            3.3.5 TRAFs與非酒精性脂肪肝炎
    4 本研究目的及意義
第二章 材料與方法
    1 主要實驗材料
        1.1 實驗動物
        1.2 動物飼料
        1.3 細胞系
        1.4 人體肝臟組織樣本
    2 儀器設備
    3 主要試劑
        3.1 抗體
        3.2 試劑盒
        3.3 試劑耗材
        3.4 溶液及緩沖液配方
    4 病毒
    5 質粒
    6 引物序列
        6.1 qPCR所用引物序列
        6.2 質粒構建所用引物序列
    7 主要實驗方法
        7.1 動物實驗
        7.2 組織病理學分析
            7.2.1 組織脫水包埋
            7.2.2 石蠟切片H&E染色
            7.2.3 冰凍切片油紅O染色
            7.2.4 石蠟切片PSR染色
            7.2.5 石蠟切片免疫組化
            7.2.6 石蠟切片免疫熒光染色
        7.3 小鼠血清細胞因子ELISA檢測
        7.4 小鼠血清肝臟脂質分析
        7.5 動物原代細胞分離
            7.5.1 小鼠原代肝細胞分離
            7.5.2 小鼠肝臟炎癥細胞分離
            7.5.3 大鼠原代HSCs分離
        7.6 免疫共沉淀分析
        7.7 外源泛素化修飾檢測
        7.8 體外泛素化實驗
        7.9 蛋白免疫印跡
            7.9.1 蛋白樣品制備
            7.9.2 SDS-PAGE電泳
            7.9.3 轉膜
            7.9.4 封閉及雜交
            7.9.5 顯影
        7.10 qPCR分析
            7.10.1 總mRNA提取
            7.10.2 逆轉錄PCR
            7.10.3 qPCR
        7.11 分子克隆-基因點突變質粒構建方法
        7.12 GST pull-down
            7.12.1 GST標簽蛋白純化
            7.12.2 Flag標簽蛋白純化
            7.12.3 Pull-down
        7.13 熒光素酶檢測技術
            7.13.1 質粒轉染
            7.13.2 雙熒光報告基因檢測
        7.14 基因特異性敲除細胞系構建-CRISPR-cas9 技術
            7.14.1 sgRNA篩選
            7.14.2 基因敲除細胞系構建
            7.14.3 敲除細胞系鑒定
        7.15 基因穩(wěn)定細胞系構建
        7.16 細胞免疫熒光分析
        7.17 細胞體外遷移實驗
        7.18 統(tǒng)計學分析
第三章 結果與分析
    1 代謝應激作用下肝細胞ASK1 對炎癥及纖維化反應影響
        1.1 高度活化的ASK1 可促進肝細胞炎癥反應
        1.2 ASK1 誘導的肝細胞炎癥可加速HSCs活化
    2 TRAF6 通過激活ASK1 促進肝細胞炎癥反應
        2.1 TRAF6 是肝細胞中ASK1 活性的關鍵激活因子
        2.2 TRAF6與ASK1 在肝細胞中具有相互作用
        2.3 TRAF6 通過激活ASK1-JNK1/2-p38 信號通路促進肝細胞炎癥反應
    3 TRAF6 通過激活ASK1 促進HSCS活化
    4 TRAF6 通過介導ASK1-K6 泛素化修飾發(fā)揮功能
        4.1 肝細胞中TRAF6 誘導ASK1 發(fā)生K6 泛素化修飾
        4.2 肝細胞中TRAF6 通過ASK1-K6 泛素化促進ASK1 活化
        4.3 ASK1-K6 泛素化對于激活ASK1 以及HSCs活化是必需的
    5 TRAF6 影響NASH的發(fā)生發(fā)展
        5.1 NASH進展中TRAF6 在肝細胞中特異性表達上調
        5.2 TRAF6 敲低可減輕HFHC喂養(yǎng)誘導的小鼠肝臟炎癥和纖維化
        5.3 肝臟過表達TRAF6 能夠加重HFHC喂養(yǎng)誘導的小鼠肝臟炎癥和纖維化
第四章 討論
    1 抑制ASK1是NASH治療的主要分子靶點
    2 TRAF6 通過激活ASK1 促進NASH發(fā)生發(fā)展
    3 TRAF6 通過介導ASK1-K6 泛素化調控NASH發(fā)生發(fā)展
    4 研究展望
參考文獻
攻博期間發(fā)表的科研成果目錄
致謝



本文編號：3838242