發(fā)布時間：2023-05-12 22:08

　　研究背景:p53功能障礙是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因。p53基因突變是p53功能失活的主要方式,在所有癌癥病例中約有一半發(fā)生p53基因突變。在沒有發(fā)生p53基因突變的腫瘤細胞中,p53正調(diào)控因子的表達下調(diào)或/和負(fù)調(diào)控因子的過度激活也可以導(dǎo)致野生型p53功能失活。本研究室前期發(fā)現(xiàn)CCDC106可以促進p53蛋白的降解,而ZCCHC10可以抑制p53蛋白的降解。本論文進一步對CCDC106和ZCCHC10在癌癥組織中的表達及其對癌癥發(fā)生發(fā)展的作用進行研究。研究方法:利用熒光定量PCR方法和Western blot實驗分別檢測基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達量。采用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建基因過表達和干擾的穩(wěn)定細胞株。采用免疫共沉淀法和GST-pull down檢測蛋白相互作用。核質(zhì)分離和免疫熒光染色檢測蛋白亞細胞定位。磷酸化抗體檢測蛋白質(zhì)的磷酸化。MTT法測定細胞活力,流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡,平板集落形成實驗檢測細胞增殖能力,傷口愈合實驗檢測細胞遷移能力,TransWell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力。采用皮下移植瘤小鼠模型研究CCDC106或ZCCHC10對體內(nèi)腫瘤生長的影響。采用尾靜脈注射小鼠模型研究Z...

【文章頁數(shù)】：117 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 p53作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮抑癌功能
        1.1.1 p53蛋白的結(jié)構(gòu)
        1.1.2 p53調(diào)控細胞周期和凋亡
        1.1.3 p53抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移
    1.2 p53基因突變是癌癥中最常見的突變
        1.2.1 p53突變的熱點和頻率
        1.2.2 突變對p53功能的影響
    1.3 MDM2介導(dǎo)p53泛素化是野生型p53失活的主要因素
        1.3.1 p53蛋白質(zhì)的泛素化主要被MDM2調(diào)控
        1.3.2 調(diào)控p53泛素化降解的其它E3連接酶
        1.3.3 調(diào)控p53去泛素化的相關(guān)途徑
        1.3.4 和p53泛素化降解有關(guān)的蛋白
    1.4 本論文的研究思路和研究意義
第二章 CCDC106在乳腺癌和宮頸癌中的作用及分子機制
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實驗材料
            2.2.1.1 細胞株和菌株
            2.2.1.2 載體和工具酶
            2.2.1.3 主要試劑與試劑盒
            2.2.1.4 抗體
        2.2.2 實驗方法
            2.2.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
            2.2.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建
            2.2.2.3 免疫共沉淀實驗
            2.2.2.4 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)
            2.2.2.5 慢病毒感染及穩(wěn)定細胞株篩選
            2.2.2.6 細胞計數(shù)法
            2.2.2.7 細胞增殖測定(MTT實驗)
            2.2.2.8 克隆形成實驗
            2.2.2.9 細胞劃痕實驗
            2.2.2.10 Trans Well法檢測細胞侵襲能力
            2.2.2.11 裸鼠皮下成瘤實驗
            2.2.2.12 RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR實驗
            2.2.2.13 藥物敏感性實驗
            2.2.2.14 免疫熒光染色
            2.2.2.15 原核融合蛋GST-p53的獲得
            2.2.2.16 細胞凋亡分析
            2.2.2.17 核質(zhì)分離
            2.2.2.18 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 干擾CCDC106 可穩(wěn)定p53,并抑制具有wtp53 的癌細胞的生長、遷移和侵襲
        2.3.2 蛋白激酶CK2 磷酸化CCDC106
        2.3.3 CCDC106在S130和S147 位點的磷酸化是與p53 相互作用和CCDC106定位所必需的
        2.3.4 抑制CCDC106的磷酸化可減弱其對p53蛋白的降解
        2.3.5 抑制CCDC106 磷酸化可以抑制CCDC106 的促癌功能
        2.3.6 CCDC106 增加具有wtp53 的癌細胞對CX-4945 的耐藥性
    2.4 結(jié)論
第三章 ZCCHC10在肺癌中的作用及分子機制
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實驗材料
            3.2.1.1 細胞株和菌株
            3.2.1.2 肺癌臨床樣本
            3.2.1.3 化學(xué)試劑和抗體
        3.2.2 實驗方法
            3.2.2.1 生物信息學(xué)分析
            3.2.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建
            3.2.2.3 慢病毒感染和穩(wěn)定細胞株構(gòu)建
            3.2.2.4 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
            3.2.2.5 免疫共沉淀實驗
            3.2.2.6 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)
            3.2.2.7 細胞計數(shù)法
            3.2.2.8 細胞增殖測定(MTT實驗)
            3.2.2.9 克隆形成實驗
            3.2.2.10 細胞劃痕實驗
            3.2.2.11 Trans Well法檢測細胞侵襲能力
            3.2.2.12 裸鼠皮下成瘤實驗
            3.2.2.13 RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR實驗
            3.2.2.14 藥物敏感性實驗
            3.2.2.15 免疫熒光染色
            3.2.2.16 細胞凋亡分析
            3.2.2.17 細胞周期分析
            3.2.2.18 裸鼠腫瘤轉(zhuǎn)移實驗
            3.2.2.20 組織切片制作以及蘇木精、伊紅染色
            3.2.2.21 免疫組化實驗
            3.2.2.22 熒光素酶報告基因?qū)嶒?br>            3.2.2.23 泛素化分析
            3.2.2.24 統(tǒng)計學(xué)分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 ZCCHC10在LUAD中表達下調(diào)
        3.3.2 ZCCHC10 抑制含有wtp53 的肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲
        3.3.3 ZCCHC10在異種移植小鼠模型中抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移
        3.3.4 ZCCHC10 通過誘導(dǎo)p53 增強肺癌細胞對順鉑的敏感性
        3.3.5 ZCCHC10與p53 相互作用并穩(wěn)定p53
        3.3.6 ZCCHC10 通過阻斷MDM2與p53 的相互作用來抑制MDM2介導(dǎo)的p53泛素化
        3.3.7 ZCCHC10 通過促進p53 的抑癌功能發(fā)揮作用
    3.4 討論
第四章 全文結(jié)論和研究展望
    4.1 全文結(jié)論
    4.2 研究展望
參考文獻
中英文縮寫表
攻讀學(xué)位期間科研成果
致謝



本文編號：3814726