背景介紹:類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性、小關節(jié)對稱的炎癥性為主的全身性的自身免疫性疾病,是導致我國人口殘疾的第二大原因。此外,雖然甲氨蝶呤等改善病情的抗風濕藥能緩解病情,卻無法徹底根治,而且有嚴重的副作用。目前RA已成為危害人類健康的重要疾病之一,但其病因尚不清楚。RA被認為與細菌感染密切相關,但其作用機制不明確。2015年7月,北京協(xié)和醫(yī)院和華大基因等機構的研究人員共同合作完成了RA患者口腔和腸道微生物元基因組研究發(fā)現口腔和腸道菌群變化是病理生理和疾控的重要環(huán)節(jié)。發(fā)表在《自然》雜志。但是這些口腔和腸道菌群參與RA的具體機制不明確。2020年3月11日,加州大學圣地亞哥分校醫(yī)學院研究人員開發(fā)了一種新穎的方法,可以通過簡單地分析血液中存在的微生物DNA的模式來識別癌癥,發(fā)表在《自然》雜志。RA的血和滑液是否存在微生物DNA不明確。我們前期研究證明RA的腸道菌群失衡,并發(fā)現普雷沃氏菌(Prevotella copri)、牙齦卟啉單胞菌、擬桿菌等顯著表達失衡。但是菌群如何參與RA的具體發(fā)病機制均不清楚。為了能夠深入研究參與RA的機制,我們采用大量...

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【學位級別】：博士

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摘要
Abstract
英文縮略語表
第一章 前言
    1.1 類風濕關節(jié)炎的概述
        1.1.1 類風濕關節(jié)炎的發(fā)病病因
        1.1.2 類風濕關節(jié)炎臨床表現
        1.1.3 類風濕關節(jié)炎臨床診斷
        1.1.4 類風濕關節(jié)炎臨床治療
    1.2 研究背景及意義
    1.3 國內外研究進展
        1.3.1 微生物可能是導致RA發(fā)病的重要病理因素
        1.3.2 腸道微生物和口腔微生物均可能導致RA的發(fā)生
            1.3.2.1 腸道微生物與RA發(fā)病的關系
            1.3.2.2 口腔菌群與RA發(fā)病的關系
        1.3.3 微生物在風濕性疾病中的代謝作用機制
        1.3.4 滑膜組織和滑膜液中是否存在微生物的核酸序列得到關注
    1.4 本研究的研究內容及技術路線
    1.5 本研究的思路擬解決的關鍵科學問題
第二章 RA中微生物與其代謝物的作用機制研究
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 臨床樣本
        2.2.2 試劑耗材
        2.2.3 儀器設備
        2.2.4 實驗方法
            2.2.4.1 滑膜液或唾液細菌DNA提取方法
            2.2.4.2 滑膜組織細菌DNA提取方法
            2.2.4.3 糞便DNA提取方法
            2.2.4.4 PCR產物擴增
            2.2.4.5 ELISA檢測炎性因子的表達
            2.2.4.6 菌群數據生物統(tǒng)計學分析
            2.2.4.7 非靶向代謝組學
            2.2.4.8 非靶向代謝組學數據分析
            2.2.4.9 特異菌群目的基因的獲取及PCR反應驗證
            2.2.4.10 瓊脂糖凝膠電泳
            2.2.4.11 驗證回收PCR產物
            2.2.4.12 質粒構建
            2.2.4.13 實時熒光定量PCR
            2.2.4.14 實時熒光定量PCR數據統(tǒng)計學分析
    2.3 結果
        2.3.1 微生物組整體測序PCoA分析
        2.3.2 整體微生物組的組成結構分布
        2.3.3 RA與 OA之間菌群差異分析
        2.3.4 基于PICRUSt算法預測微生物的功能
        2.3.5 滑膜液中非靶向代謝組學整體PCoA分析
        2.3.6 滑膜液中代謝產物的整體結構
        2.3.7 代謝物的KEGG通路分析
        2.3.8 RA腸道菌群、口腔菌群與滑膜液中菌的核酸片段的一致性
        2.3.9 PCR定量分析結果
            2.3.9.1 擬桿菌的定量結果
            2.3.9.2 普雷沃氏菌的定量結果
            2.3.9.3 牙齦卟啉單胞菌的定量結果
    2.4 討論
    2.5 結論
第三章 益生菌對類風濕關節(jié)炎成纖維細胞的作用機制
    3.1 引言
    3.2 材料及方法
        3.2.1 樣本采集
        3.2.2 主要試劑及耗材
        3.2.3 實驗方法
            3.2.3.1 類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞的原代培養(yǎng)
            3.2.3.2 類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞的傳代培養(yǎng)
            3.2.3.3 原代培養(yǎng)滑膜成纖維細胞的鑒定
            3.2.3.4 滑膜細胞計數
            3.2.3.5 益生菌群刺激類風濕滑膜成纖維細胞
            3.2.3.6 采用MTS法檢測細胞增殖能力
            3.2.3.7 采用劃痕法檢測細胞遷移能力
            3.2.3.8 采用Transwell法檢測細胞侵襲能力
            3.2.3.9 ELISA酶聯(lián)免疫實驗方法檢測炎性因子水平
            3.2.3.10 統(tǒng)計學方法
    3.3 結果
        3.3.1 MTS方法檢測益生菌干預細胞增殖能力
        3.3.2 劃痕法檢測益生菌干預表對RA FLS遷移能力的影響
        3.3.3 Transwell方法檢測益生菌干預對RA FLS侵襲能力的影響
        3.3.4 ELISA法檢測炎性因子的表達
    3.4 討論
    3.5 結論
第四章 益生菌群對膠原誘導性關節(jié)炎的機制研究
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 材料
            4.2.1.1 實驗動物
            4.2.1.2 主要試劑耗材
            4.2.1.3 主要儀器
        4.2.2 實驗方法
            4.2.2.1 構建Ⅱ型膠原誘導性DBA1 小鼠關節(jié)炎模型
            4.2.2.2 關節(jié)炎的評分
            4.2.2.3 病理組織學分析
            4.2.2.4 小鼠CT掃描骨骼的變化
            4.2.2.5 小鼠糞便樣本收集
            4.2.2.6 糞便DNA提取方法同2.2.4.3
            4.2.2.7 PCR產物擴增
            4.2.2.8 ELISA法檢測小鼠血清中IL-17、IL-6、IL-1α的水平
    4.3 結果
        4.3.1 膠原誘導性關節(jié)小鼠誘導成功
        4.3.2 16SrRNA V1-V2 區(qū)測序分析整體微生物組變化
        4.3.3 膠原誘導性關節(jié)炎小鼠腸道菌群β-多樣性差異
        4.3.4 通過Veen圖比較各組OTU分布差異
        4.3.5 膠原誘導性關節(jié)炎小鼠腸道菌群的門分類水平差異
        4.3.6 膠原誘導性關節(jié)炎小鼠的腸道菌群屬分類水平的差異
        4.3.7 各組膠原誘導性關節(jié)炎小鼠腸道菌群差異分析
        4.3.8 CT掃描顯示益生菌對CIA小鼠具有保護作用
        4.3.9 病理組織學分析益生菌制劑干預CIA小鼠結構
        4.3.10 益生菌制劑可調節(jié)炎性細胞因子水平
    4.4 討論
    4.5 結論
總結與展望
參考文獻
致謝
攻讀學位期間所取得的成果



本文編號：3781197