本文關鍵詞：膽管瘢痕差異蛋白研究及Activin B在UDCA治療瘢痕中作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[研究目的]從蛋白質轉錄水平研究良性膽管增生性癱痕形成的分子機理,同時為膽管增生性瘢痕的發(fā)病機制研究提供線索,為臨床研究和治療膽管增生性瘢痕提供實驗室依據(jù)。[研究方法]1.原代培養(yǎng)人肝內膽管正常成纖維細胞和瘢痕成纖維細胞,MTT檢測正常及瘢痕成纖維細胞生長情況；2.蛋白芯片檢測膽管正常成纖維細胞和瘢痕成纖維細胞差異蛋白,對差異蛋白進行Pathway分析和GO功能注釋,從中選取Act B、 TGF-β1、ET-1、Tsp-1和OSM作為后續(xù)實驗目標蛋白；3. ELISA驗證膽管瘢痕組織差異蛋白；4. siRNA-Act B轉染瘢痕成纖維細胞,RT-PCR檢測Act B mRNA表達,流式細胞儀檢測細胞凋亡,Western-blot檢測差異蛋白表達；5.重組人Act B蛋白干預正常成纖維細胞,流式細胞儀檢測細胞周期,Western-blot檢測差異蛋白表達；6.MTT檢測12種膽汁酸對瘢痕成纖維細胞活力的影響；7.流式細胞儀檢測膽酸、脫氧膽酸對瘢痕成纖維細胞周期的影響；8.細胞計數(shù)、MTT和劃痕愈合實驗檢測膽酸和脫氧膽酸聯(lián)合對瘢痕成纖維細胞活力的影響；9.流式細胞儀檢測熊脫氧膽酸對瘢痕成纖維細胞凋亡的影響；10.Western-blot檢測熊脫氧膽酸對瘢痕成纖維細胞差異蛋白的影響；11.用熊脫氧膽酸喂食膽總管瘢痕狹窄模型的家兔,連續(xù)觀察30天、90天和180天；12.檢測熊脫氧膽酸對血清肝功能的影響；13.HE染色和Masson染色分別觀察熊脫氧膽酸對瘢痕增生指數(shù)和膠原纖維面密度的影響；14.免疫組織化學法檢測熊脫氧膽酸對瘢痕組織Act B和Smad2/3表達的影響；15.Western-blot檢測熊脫氧膽酸對瘢痕組織差異蛋白表達的影響。[研究結果]1.原代培養(yǎng)的正常成纖維細胞和瘢痕成纖維細胞細胞形態(tài)不同,vimentin免疫熒光檢測二者細胞都為陽性表達,瘢痕成纖維細胞生長速度明顯快于正常成纖維細胞；2.蛋白芯片檢測507個蛋白,共發(fā)現(xiàn)有37個差異蛋白,與正常成纖維細胞相比,在瘢痕成纖維細胞中表達上調的蛋白有27個,表達下調的蛋白有10個(P0.05),其功能與細胞外基質的合成與降解、細胞因子的生成和激活、炎癥免疫反應、組織損傷反應、細胞周期、細胞遷移、細胞凋亡、細胞分泌和結合激活素等有關；3.ELISA驗證Act B、TGF-β1、ET-1、Tsp-1和OSM蛋白表達情況符合蛋白芯片的結果；4. siRNA-Act B干擾組Act B mRNA表達量顯著下降(P0.01)。干擾組早期凋亡、晚期凋亡及壞死百分比升高(P0.01)。干擾組Act B、Smad2/3和TGF-β1蛋白表達量降低(P0.05),其中TGF-β1 (P0.01),而干擾組Tsp-1和OSM蛋白表達量升高(P0.05),其中OSM (P0.01);5.重組人Act B蛋白過表達組細胞周期G0/G1期百分比降低,S期百分比上升(P0.05)。過表達組Act B、Smad2/3和TGF-β1蛋白表達量升高(P0.05),而過表達組Tsp-1和OSM蛋白表達量顯著降低(P0.01)；6.膽汁酸濃度在0.5-5μmol/L之間時,僅膽酸和脫氧膽酸促進瘢痕成纖維細胞活力(P0.05),其他膽汁酸對瘢痕成纖維細胞的活力無明顯影響(P0.05),濃度在20-500μmol/L,絕大多數(shù)膽汁酸都抑制了瘢痕成纖維細胞的活力(P0.05)；7.膽酸、脫氧膽酸使瘢痕成纖維細胞G0/G1期百分比降低,S期百分比上升(P0.05)；8.膽酸和脫氧膽酸聯(lián)合干預瘢痕成纖維細胞,聯(lián)合組細胞計數(shù)和細胞活力增加,劃痕愈合距離縮小(P0.05)；9.熊脫氧膽酸促進瘢痕成纖維細胞凋亡；10.熊脫氧膽酸抑制瘢痕成纖維細胞Act B、Smad2/3和TGF-β1蛋白表達量(P0.05),升高Tsp-1和OSM蛋白表達(P0.05)；11.膽總管瘢痕狹窄模型制備成功；12.熊脫氧膽酸能適度改善血清肝功能指標；13.熊脫氧膽酸能輕度減少瘢痕增生指數(shù)和膠原纖維面密度；14.180d觀察發(fā)現(xiàn)UDCA組與瘢痕組Act B和Samd2/3總體評分分布有統(tǒng)計學差異(P0.05),且服藥與總體評分有相關性。30d、90d和180天連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)Act B和Samd2/3總體評分隨時間推移而減少(P0.05),時間長短與總體評分有相關性；15.熊脫氧膽酸抑制瘢痕組織Act B、Smad2/3、TGF-β1和ET-1蛋白表達(P0.05),升高Tsp-1蛋白表達(P0.05)。[研究結論]1.人肝內膽管瘢痕成纖維細胞和正常成纖維細胞存在蛋白表達差異,其中Activin B、TGF-β1、ET-1、Tsp-1和OSM與瘢痕形成有關。2. Activin B信號在膽管正常成纖維細胞向瘢痕成纖維細胞轉化過程中起著重要作用,TGF-β1、Smad2/3、Tsp-1和OSM是重要的參與者。3.低濃度的膽酸和脫氧膽酸可促進瘢痕成纖維細胞生長。4. UDCA可抑制瘢痕成纖維細胞的生長,促進其凋亡。其機制是通過ActivinB信號調控TGF-β1、Smad2/3、Tsp-1和OSM蛋白的表達。5. UDCA可適度改善良性膽總管瘢痕狹窄動物肝功能、瘢痕增生指數(shù)、膠原纖維面密度指標,且改善程度與時間長短相關。其機制是通過Activin B信號調控TGF-β1、Smad2/3、ET-1和Tsp-1蛋白的表達。
【關鍵詞】：膽管 瘢痕 成纖維細胞 熊脫氧膽酸 Activin B
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R657.4
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 引言14-16
• 第一部分 人肝內膽管正常成纖維細胞和瘢痕成纖維細胞的體外培養(yǎng)及差異蛋白研究16-72
• 前言16
• 材料與方法16-38
• 結果38-60
• 討論60-66
• 結論66-67
• 參考文獻67-72
• 第二部分 膽汁酸對人肝內膽管瘢痕成纖維細胞生長影響的研究及熊脫氧膽酸對瘢痕成纖維細胞生長影響機制的探討72-95
• 前言72
• 材料與方法72-79
• 結果79-85
• 討論85-90
• 結論90-91
• 參考文獻91-95
• 第三部分 熊脫氧膽酸對家兔良性膽總管瘢痕狹窄的影響及機制探討95-118
• 前言95
• 材料與方法95-103
• 結果103-112
• 討論112-114
• 結論114-115
• 參考文獻115-118
• 全文總結118-119
• 文獻綜述119-130
• 參考文獻125-130
• 攻讀博士學位期間主要研究成果130-131
• 致謝131

【引證文獻】

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 柴成偉;魏明發(fā);馮杰雄;吳曉娟;鄭帥玉;王小林;;環(huán)氧化酶-2在甘氨鵝脫氧膽酸鈉致膽管上皮細胞癌變中的機理研究[A];中華醫(yī)學會第八次全國小兒外科學術會論文集[C];2010年

2 賀偉峰;吳軍;羅高興;甘成軍;程文廣;袁順宗;彭旭;賈雄飛;譚江琳;王曉娟;胡婕;黃正根;楊世偉;陳希煒;張小容;;增生性瘢痕組織和正常皮膚來源的成纖維細胞分泌蛋白的差異蛋白質組學研究[A];中華醫(yī)學會燒傷外科學分會2009年學術年會論文匯編[C];2009年

  本文關鍵詞：膽管瘢痕差異蛋白研究及Activin B在UDCA治療瘢痕中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：377389