本文關(guān)鍵詞：STK33基因在下咽鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的下咽癌是頭頸部常見惡性腫瘤之一,尚缺乏有效的治療手段。STK33是一個(gè)非常有潛力的進(jìn)行有效分子治療的基因,但是其在惡性腫瘤中的相關(guān)生物功能和分子機(jī)制尚不清楚。本課題擬借助RNM技術(shù)明確STK33對(duì)下咽癌細(xì)胞株Fadu細(xì)胞生物學(xué)行為增殖與凋亡、細(xì)胞周期、腫瘤細(xì)胞克隆集落能力、侵襲和轉(zhuǎn)移、以及上皮細(xì)胞間葉轉(zhuǎn)化的影響,并通過分子生物學(xué)技術(shù)了解其中可能存在的分子機(jī)制以及ERK1/2信號(hào)通路在其中可能存在的調(diào)節(jié)作用。研究方法：1.Fadu細(xì)胞中STK33的表達(dá)及STK33-RNAi慢病毒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染1)通過IHC方法檢測(cè)30例人下咽癌組織與配對(duì)的正常粘膜組織中STK33的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。2)構(gòu)建STK33-RNAi和對(duì)照慢病毒載體,并進(jìn)行RNAi慢病毒包裝和滴度檢測(cè)。3)將STK33-RNAi和對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染入Fadu細(xì)胞中,并進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率測(cè)定。4)Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染慢病毒后Fadu細(xì)胞中STK33蛋白表達(dá)的變化。2.STK33-RNAi和PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞增殖與凋亡的影響1)Fadu細(xì)胞復(fù)蘇、傳代培養(yǎng),按照Mock、5 μM PD98059、STK33-RNAi、STK33-RNAi 5μM PD98059進(jìn)行分組。2)MTT實(shí)驗(yàn)首先確定PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞作用的最佳濃度和時(shí)間,在此基礎(chǔ)上了解STK33-RNAi和PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞活性的影響。3)Hoechst.33342PI雙染實(shí)驗(yàn)了解STK33-RNAi和5μM PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞凋亡的影響。4)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)了解STK33-RNAi和5μM PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。5)腫瘤細(xì)胞克隆集落形成實(shí)驗(yàn)了解STK33-RNAi和5μM PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞克隆集落形成能力的影響。6)通過Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)了解STK33和ERK1/2之間可能存在的關(guān)系。7)通過Real-time PCR了解STK33-RNAi和5μM PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2、Ki-67在mRNA水平的影響。8)通過Western blot實(shí)驗(yàn)從蛋白水平了解STK33-RNAi和5μM PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2、Ki-67的影響。3. STK33-RNAi和5 μM PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及上皮問葉轉(zhuǎn)化的影響1)IHC方法檢測(cè)STK33在人下咽癌組織不同分化程度、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否中的表達(dá)情況2) Fadu細(xì)胞復(fù)蘇、傳代培養(yǎng),按照Mock、5 μM PD98059、STK33-RNAi、STK33-RNAi 5μM PD98059進(jìn)行分組。3)腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)了解STK33-RNAi和5 μM PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移行為的影響。4)通過Real-time PCR了解STK33-RNAi和5μM PD98059 對(duì) Fadu細(xì)胞上皮細(xì)胞間葉轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因E-cadherin、Vimentin、Nm-23在mRNA水平的影響。5)通過Western blot實(shí)驗(yàn)從蛋白水平了解STK33-RNAi和5μM PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞上皮細(xì)胞間葉轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因E-cadherin、Vimentin、 Nm-23的影響。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPASS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析處理。計(jì)量資料用Mean±SD或Mean±SE表示,應(yīng)用one-way ANOVA分析進(jìn)行數(shù)據(jù)的組間比較,以P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.STK33在人下咽癌組織中的表達(dá)及STK33-RNAi慢病毒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染入Fadu細(xì)胞1)IHC結(jié)果表明配對(duì)的人原位下咽癌組織(11.63±3.56)、浸潤(rùn)性下咽癌組織(13.974±3.47)與正常粘膜鱗狀上皮細(xì)胞(4.17±3.38)中STK33的蛋白質(zhì)表達(dá)均有顯著性差異(P0.05),而且STK33在原位癌和浸潤(rùn)性癌之間的表達(dá)也有明顯差異(P0.05)。2)成功構(gòu)建STK33-RNAi和對(duì)照慢病毒載體,并將其成功轉(zhuǎn)染入Fadu細(xì)胞內(nèi)。3)與對(duì)照組相比較,STK33-RNAi能顯著性降低STK33在Fadu細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)水平。2. STK33-RNAi和PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞增殖與凋亡的影響1)通過MTT實(shí)驗(yàn)確定5μM PD98059作用Fadu細(xì)胞48 h是PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞作用的最佳濃度和時(shí)間的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明與對(duì)照組相比較,STK33-RNAi和5μM PD98059不僅能分別顯著性降低Fadu細(xì)胞活性,而且二者在此作用上具有協(xié)同效應(yīng)。2) Hoechst.33342PI雙染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明與對(duì)照組相比較,STK33-RNAi和5 μM PD9809均分別導(dǎo)致Fadu細(xì)胞凋亡,并能協(xié)同導(dǎo)致Fadu細(xì)胞凋亡。3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示與對(duì)照組相比較,STK33-RNAi對(duì)Fadu細(xì)胞的G2/M期具有阻滯作用,5μM PD98059阻滯Fadu細(xì)胞的G0/G1期。4)腫瘤細(xì)胞克隆集落形成實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比較,STK33-RNAi和 5 μMPD98059具有分別以及協(xié)同降低Fadu細(xì)胞克隆集落形成的能力。5) Real-time PCR和 Western blot實(shí)驗(yàn)一致性表明,在Fadu細(xì)胞中,與對(duì)照組相比較,5 μM PD98059能明顯降低STK33的表達(dá),而ERK1/2的表達(dá)在對(duì)照組和STK33-RNAi組中沒有顯著性差異。6) Real-time PCR 和 Western blot實(shí)驗(yàn)一致性顯示,在Fadu細(xì)胞中,與對(duì)照組比較,STK33-RNAi和5μM PD98059均能夠單獨(dú)以及協(xié)同性顯著地降低Bcl-2表達(dá)的同時(shí)明顯增加Ki-67的表達(dá)；另外,STK33-RNAi能夠明顯增加Caspase-3的表達(dá),而5μM PD98059對(duì)Caspase-3的作用與對(duì)照組比較則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3. STK33-RNAi和PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及上皮問葉轉(zhuǎn)化的影響1)免疫組化結(jié)果顯示STK33表達(dá)在非角化型鱗癌中顯著性高于角化型鱗癌,在腫瘤2 cm中明顯高于腫瘤2 cm；而且,STK33的IHC得分隨著臨床分期的增高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移都明顯增加。2)腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,STK33-RNAi和5μM PD98059均能夠單獨(dú)以及協(xié)同性顯著地降低Fadu細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。3) Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在Fadu細(xì)胞中,與對(duì)照組相比較,STK33-RNAi和5 μM PD98059具有分別以及協(xié)同性顯著地增加Nm-23和E-cadherin的mRNA表達(dá)水平；另外,STK33-RNAi和5μMPD98059能分別明顯降低Vimentin的mRNA表達(dá)水平。4) Western blot檢測(cè)表明,在Fadu細(xì)胞中,與對(duì)照組相比較,STK33-RNAi 和5μM PD98059具有分別以及協(xié)同性顯著地增加Nm-23和 E-cadherin的蛋白質(zhì)表達(dá)水平；另外,STK33-RNAi 和 5μM PD98059能分別明顯降低Vimentin的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)論和意義：1.我們的研究首次證明STK33在人下咽癌組織中明確表達(dá),并且可能在下咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要促進(jìn)作用。2. STK33-RNAi能顯著性降低Fadu細(xì)胞的活性,可能通過增加Caspase-3的表達(dá)和降低Bcl-2的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡：另外,可能通過下調(diào)Ki-67的表達(dá)與Fadu細(xì)胞阻滯于G2/M期有關(guān),同時(shí)與下調(diào)Fadu細(xì)胞克隆集落形成能力有關(guān)。STK33可能是ERK1/2信號(hào)通路的下游因子,STK33促進(jìn)Fadu細(xì)胞增殖和克隆集落形成能力、影響細(xì)胞周期以及抑制細(xì)胞凋亡可能是通過ERK1/2信號(hào)通路的作用影響下咽癌的演進(jìn),此結(jié)果為STK33做為下咽癌分子靶向治療的潛在因子提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。3.STK33高表達(dá)與人下咽癌組織的分化差、轉(zhuǎn)移、臨床分期增高相關(guān)。STK33可能通過參與ERK1/2信號(hào)通路而協(xié)同性抑制E-cadherin的作用,另外通過誘導(dǎo)、Vimentin的作用促進(jìn)EMT的發(fā)生,同時(shí)可能通過ERK1/2信號(hào)通路下調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因Nm-23的作用,進(jìn)而增加Fadu細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力促使下咽癌的進(jìn)展更為迅速,此結(jié)果為STK33做為下咽癌分子靶向治療的潛在因子提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：STK33 ERK1/2 RNA干擾 下咽癌 增殖與凋亡 侵襲和轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 摘要6-10
• ABSTRACT10-13
• 符號(hào)說明13-16
• 前言16-22
• 第一章 STK33在人下咽癌組織和Fadu細(xì)胞中的表達(dá)及STK33-RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定22-70
• 1. 實(shí)驗(yàn)流程22
• 2. 材料與方法22-61
• 3. 結(jié)果61-66
• 4. 討論66-70
• 第二章 STK33和ERK1/2對(duì)Fadu細(xì)胞增殖與凋亡的影響70-85
• 1. 實(shí)驗(yàn)流程70
• 2. 材料與方法70-78
• 3. 結(jié)果78-81
• 4. 討論81-85
• 第三章 STK33和ERK1/2對(duì)人下咽癌組織和Fadu細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及上皮間葉轉(zhuǎn)化的影響85-93
• 1. 實(shí)驗(yàn)流程85
• 2. 材料與方法85-87
• 3. 結(jié)果87-89
• 4. 討論89-93
• 附圖表93-103
• 參考文獻(xiàn)103-111
• 致謝111-112
• 學(xué)術(shù)論文目錄112-113
• 附英文論文1113-162
• 附英文論文2162-199

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 許哲源;王平;李琳;楊慧;麻新梅;呂東津;梁銳;;STK33基因在肺癌 乳腺癌 結(jié)腸癌組織中表達(dá)的研究[J];中國(guó)腫瘤臨床;2010年15期

  本文關(guān)鍵詞：STK33基因在下咽鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：376176