發(fā)布時(shí)間：2023-02-19 13:35

　　淋巴細(xì)胞特異性酪氨酸蛋白激酶(Lck)在T細(xì)胞受體(TCR)信號(hào)通路啟動(dòng)過(guò)程中起著非常重要的作用。在經(jīng)典的TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,當(dāng)TCR與配體結(jié)合而被激活時(shí),最先被檢測(cè)到的分子事件即是激活的Lck磷酸化CD3-ζ鏈中的ITAM基序上的酪氨酸殘基。磷酸化的ITAM作為停泊位點(diǎn)招募Zap70激酶,隨后招募至此的Zap70激酶因被激活的Lck磷酸化而激活,參與TCR信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。但是,在這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中,Lck蛋白激酶的動(dòng)態(tài)激活調(diào)節(jié)機(jī)制還沒(méi)有得到很好的研究。Lck激酶活性的調(diào)節(jié)與其酪氨酸394和酪氨酸505殘基的磷酸化水平密切相關(guān)。通常認(rèn)為酪氨酸505的磷酸化抑制了Lck的激酶活性,它的突變會(huì)造成Lck的持續(xù)激活。而酪氨酸394的磷酸化促進(jìn)了Lck的激酶活性,它的突變則會(huì)導(dǎo)致Lck激酶活性喪失,但是也有一些研究小組持有不同的看法�？梢�(jiàn),酪氨酸394殘基在調(diào)節(jié)Lck激酶活性中的功能作用是有爭(zhēng)議的。而且先前的研究報(bào)道對(duì)Lck激酶預(yù)激活狀態(tài)的存在也有爭(zhēng)議。通常用于研究Lck激酶活性調(diào)節(jié)的方法為生物化學(xué)方法,如Western Blot,這種經(jīng)典方法并不能有效地監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中Lck激酶活性的動(dòng)態(tài)變化...

【文章頁(yè)數(shù)】：148 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
主要縮略詞
1 緒論
    1.1 問(wèn)題的提出與意義
    1.2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.2.1 TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中分子事件的研究現(xiàn)狀
        1.2.2 Lck結(jié)構(gòu)和功能的研究現(xiàn)狀
        1.2.3 熒光共振轉(zhuǎn)移原理在生物學(xué)研究中的應(yīng)用
    1.3 研究目的以及研究?jī)?nèi)容
        1.3.1 研究目的
        1.3.2 研究?jī)?nèi)容
2 新型LckFRET生物探針的構(gòu)建以及體外表征
    2.1 前言
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
        2.2.3 配制的溶液和試劑
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 重組LckFRET生物探針質(zhì)粒和Src FRET生物探針質(zhì)粒的擴(kuò)增
        2.3.2 LckFRET生物探針蛋白和Src FRET生物探針蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.3.3 純化LckFRET生物探針蛋白和Src FRET生物探針蛋白
        2.3.4 體外激酶分析法
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 LckFRET生物探針蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化
        2.4.2 LckFRET生物探針在體外對(duì)激活的Src激酶的靈敏性
        2.4.3 Lck生物探針的FRET信號(hào)變化與探針?lè)肿涌臻g構(gòu)象變化的關(guān)系
    2.5 討論
    2.6 本章小結(jié)
3 LckFRET生物探針的特異性底物肽的篩選
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)
        3.3.2 293T細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.3.3 pSIN-Zap Lck、pSIN-LckWT、pSIN-LckY394F和pSIN-LckK273R重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.4 慢病毒包裝
        3.3.5 慢病毒收集
        3.3.6 慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞
        3.3.7 電轉(zhuǎn)染(Electroporation)
        3.3.8 CD3/CD28抗體復(fù)合物的配制
        3.3.9 活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)
        3.3.10 IP/IB(免疫沉淀和免疫印跡)
    3.4 結(jié)果
        3.4.1 重組質(zhì)粒pSIN-Zap Lck、pSIN-LckWT、pSIN-LckY394F和pSIN-LckK273R的構(gòu)建
        3.4.2 Jurkat細(xì)胞中Lck-FRET-Zap70FY生物探針對(duì)Lck激酶活性的監(jiān)測(cè)
        3.4.3 Lck-FRET-Zap70FY生物探針對(duì)Lck激酶活性監(jiān)測(cè)的特異性
        3.4.4 T細(xì)胞中LckY394F激酶活性檢測(cè)
        3.4.5 內(nèi)源性Zap70對(duì)Zap Lck生物探針底物肽磷酸化的影響
        3.4.6 Fyn FRET生物探針對(duì)T細(xì)胞中Fyn激酶的活性監(jiān)測(cè)
    3.5 本章討論
    3.6 本章小結(jié)
4 Lck激酶在T細(xì)胞中的預(yù)先激活評(píng)估
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 PBMC細(xì)胞分離與培養(yǎng)
        4.3.2 重組質(zhì)粒pSIN-LckWT-mCherry和pSIN-LckY394F-mCherry的構(gòu)建
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 Jurkat細(xì)胞中內(nèi)源性LckWT激酶的預(yù)先激活評(píng)估
        4.4.2 PBMC細(xì)胞中Lck激酶預(yù)先激活部分的評(píng)估
        4.4.3 重組質(zhì)粒pSIN-LckWT-mCherry和pSIN-LckY394F-mCherry的構(gòu)建
        4.4.4 LckWT和LckY394F在T細(xì)胞中的分布
    4.5 本章討論
    4.6 本章小結(jié)
5 Lck激酶介導(dǎo)ERK激酶的快速激活
    5.1 前言
    5.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 pcDNA3.1-ERK FRET生物探針質(zhì)粒的擴(kuò)增
        5.3.2 Western Blot
        5.3.3 活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)
    5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.4.1 LckY394F轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR信號(hào)至下游分子ERK
        5.4.2 ERK蛋白水平的磷酸化
        5.4.3 PP1預(yù)處理對(duì)LckY394F介導(dǎo)的ERK激酶的快速激活的影響
    5.5 討論
    5.6 本章小結(jié)
6 T細(xì)胞共受體CD3和CD28在Lck激活中的重要作用
    6.1 前言
    6.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        6.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        6.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    6.3 實(shí)驗(yàn)方法
        6.3.1 抗體復(fù)合物的配制
        6.3.2 活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)
    6.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.4.1 不同濃度CD3/CD28抗體復(fù)合物刺激對(duì)Lck激酶激活的影響
        6.4.2 不同濃度CD3受體-抗體結(jié)合對(duì)Lck激酶激活的影響
        6.4.3 CD28受體-抗體結(jié)合對(duì)Lck激酶激活的影響
    6.5 本章討論
    6.6 本章小結(jié)
7 LckWT和LckY394F表達(dá)水平與其激酶活性之間的關(guān)系
    7.1 前言
    7.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        7.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        7.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    7.3 實(shí)驗(yàn)方法
        7.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        7.3.2 慢病毒包裝
        7.3.3 抗體復(fù)合物的配制
        7.3.4 活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)
    7.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        7.4.1 重組質(zhì)粒pSIN-LckK273R-mCherry的構(gòu)建
        7.4.2 Lck表達(dá)水平與其基礎(chǔ)活性之間的關(guān)系
        7.4.3 Lck表達(dá)水平對(duì)其激酶激活動(dòng)力學(xué)的影響
    7.5 本章討論
    7.6 本章小結(jié)
8 LckWT和LckY394F不同的激酶調(diào)節(jié)模式
    8.1 前言
    8.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        8.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        8.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    8.3 實(shí)驗(yàn)方法
        8.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        8.3.2 熒光漂白與恢復(fù)實(shí)驗(yàn)
        8.3.3 BiFC-splitVenus體系活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)
    8.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        8.4.1 Lck在T細(xì)胞中的擴(kuò)散速率
        8.4.2 Lck-Bi FC-split-Venus體系相關(guān)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        8.4.3 細(xì)胞中Lck激酶分子間的相互作用
    8.5 本章討論
    8.6 本章小結(jié)
9 結(jié)論、不足與展望
    9.1 主要結(jié)論
    9.2 工作不足之處
    9.3 工作展望
參考文獻(xiàn)
附錄
    A 作者在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文及專利情況
        論文
        專利
    B 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集
致謝



本文編號(hào)：3746321