發(fā)布時間：2023-01-03 09:29

　　乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）慢性感染是肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）發(fā)生和發(fā)展的主要誘導因素之一。雖然乙肝疫苗的普及大大減少了新感染的數(shù)量,而核苷類似物和干擾素等抗病毒藥物的治療也極大地降低了感染患者的死亡率。但由于現(xiàn)有的藥物不能完全清除HBV感染過程中產(chǎn)生的共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）,導致目前全世界仍有超過3.5億慢性乙肝病毒感染者,每年約88.7萬人死于HBV引起的肝硬化、肝癌及其并發(fā)癥。故為探索乙型肝炎和肝癌的新的治療靶點和開發(fā)新的治療藥物提供理論依據(jù),需要進一步研究HBV的持續(xù)性復制和致病機制。越來越多的證據(jù)表明微小RNA（microRNAs,miRNAs）參與HBV復制和HBV相關肝癌的發(fā)生。miRNA是一類短的、內(nèi)源性的非編碼RNA,可通過與靶基因mRNA的3’-非翻譯區(qū)（3’-Untranslated regions,3’-UTR）上的種子序列互補配對結合,調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平。有研究表明,HBV可上調(diào)或下調(diào)胞內(nèi)多種miRNAs的表達... 

【文章頁數(shù)】：151 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 研究背景
    1.1 乙型肝炎病毒(HBV)研究現(xiàn)狀概述
        1.1.1 HBV的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 HBV的基因組結構和編碼的蛋白
        1.1.3 HBV的感染周期
        1.1.4 HBx的功能研究
    1.2 HBV利用自噬反應促進自身復制
        1.2.1 自噬的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 自噬的分類
        1.2.3 自噬反應發(fā)生的過程
        1.2.4 HBV利用自噬促進自身復制
    1.3 miRNA在 HBV誘導自噬反應中的研究進展
        1.3.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)
        1.3.2 miRNA的產(chǎn)生和功能
        1.3.3 miRNA與自噬
        1.3.4 miRNA與 HBV
        1.3.5 miRNA在 HBV誘導自噬反應中的調(diào)控作用
    1.4 NF-κB信號通路的研究進展
        1.4.1 NF-κB信號通路的組成
        1.4.2 NF-κB信號通路的類別
        1.4.3 HBV/HBx調(diào)控NF-κB信號通路的活性
        1.4.4 NF-κB信號通路與自噬
    1.5 XIAP的研究進展
    1.6 本章小結
第二章 材料與方法
    2.1 實驗相關儀器設備
    2.2 實驗材料與試劑
        2.2.1 細胞,細胞培養(yǎng)與細胞轉(zhuǎn)染
        2.2.2 表達質(zhì)粒的構建
        2.2.3 化學藥品,抗體和其他試劑
        2.2.4 細胞/組織/血清中的RNA提取
        2.2.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑
        2.2.6 免疫印跡(western blot)所用試劑
        2.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炈貌牧?br>        2.2.8 共聚焦和透射電鏡觀察自噬體所用材料
        2.2.9 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒
        2.2.10 Southern blot and Northern blot所用試劑
        2.2.11 免疫共沉淀實驗(Co-IP)
        2.2.12 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗所用試劑
        2.2.13 小鼠尾靜脈高壓注射相關材料
        2.2.14 本研究所用引物列表
    2.3 實驗步驟
        2.3.1 細胞相關實驗
        2.3.2 質(zhì)粒的構建與擴增
        2.3.3 RNA的提取
        2.3.4 qRT-PCR實驗
        2.3.5 免疫印跡(western blot)
        2.3.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?br>        2.3.7 激光共聚焦顯微鏡觀察自噬體
        2.3.8 ELISA檢測HBV抗原分泌
        2.3.9 Southern blot 和 Northern blot 實驗
        2.3.10 Co-IP 實驗
        2.3.11 CHIP 實驗
        2.3.12 Balb/C小鼠尾靜脈高壓注射
        2.3.13 HBV病毒的濃縮與定量
        2.3.14 HBV病毒感染人原代肝細胞
第三章 實驗結果
    3.1 HBV感染抑制miR-192-3p的表達
        3.1.1 研究背景
        3.1.2 HBV濃度梯度抑制miR-192-3p的分泌
        3.1.3 HBV濃度梯度抑制miR-192-3p的胞內(nèi)表達
        3.1.4 HBV通過HBx抑制miR-192-3p轉(zhuǎn)錄
        3.1.5 c-Myc顯著抑制miR-192-3p的水平
        3.1.6 HBx通過穩(wěn)定c-Myc表達而抑制miR-192-3p的水平
        3.1.7 HBx與c-Myc共同結合miR-192 的啟動子
    3.2 HBV抑制miR-192-3p而上調(diào)XIAP的表達
        3.2.1 研究背景
        3.2.2 篩選miR-192-3p的靶基因
        3.2.3 確證XIAP作為miR-192-3p的靶基因
        3.2.4 HBV抑制miR-192-3p而上調(diào)XIAP的表達
    3.3 HBV通過miR-192-3p-XIAP軸誘導自噬
        3.3.1 研究背景
        3.3.2 HBV誘導自噬發(fā)生
        3.3.3 miR-192-3p抑制自噬反應但不影響自噬流
        3.3.4 miR-192-3p抑制HBV誘導的自噬反應
        3.3.5 XIAP誘導自噬
        3.3.6 Anti-miR-192-3p通過上調(diào)XIAP而促進自噬
        3.3.7 HBV調(diào)控miR-192-3p-XIAP軸誘導自噬
    3.4 HBV通過miR-192-3p-XIAP誘導自噬而促進HBV復制
        3.4.1 研究背景
        3.4.2 miR-192-3p抑制HBV殼體化DNA的水平和抗原分泌
        3.4.3 XIAP促進HBV復制
        3.4.4 Anti-miR-192-3p通過上調(diào)XIAP而促進病毒復制
        3.4.5 HBV調(diào)控miR-192-3p-XIAP軸誘導HBV自身復制
    3.5 HBV通過miR-192-3p-XIAP軸調(diào)控NF-ΚB通路誘導自噬而促進HBV復制
        3.5.1 研究背景
        3.5.2 miR-192-3p靶向XIAP抑制NF-κB信號通路
        3.5.3 HBV通過miR-192-3p上調(diào)XIAP激活NF-κB信號通路
        3.5.4 SC-514 抑制NF-κB信號通路減弱了HBV誘導的自噬和HBV病毒復制
        3.5.5 SN50 抑制NF-κB信號通路減弱了HBV誘導的自噬和HBV病毒復制
    3.6 體內(nèi)實驗證實HBV通過miR-192- 3p-XIAP軸誘導自噬并且促進其自身的復制
        3.6.1 研究背景
        3.6.2 在小鼠體內(nèi)HBV急性感染抑制miR-192-3p的表達
        3.6.3 在小鼠體內(nèi)HBV-miR-192-3p-XIAP軸誘導自噬
        3.6.4 在小鼠體內(nèi)HBV通過miR-192-3p-XIAP軸促進自身復制
    3.7 HBV病毒感染人的原代肝細胞后抑制miR-192-3p而上調(diào)XIAP水平進而誘導自噬并且促進其自身的復制
        3.7.1 研究背景
        3.7.2 HBV感染原代肝細胞抑制miR-192-3p的表達
        3.7.3 HBV感染原代肝細胞促進XIAP的轉(zhuǎn)錄
        3.7.4 miR-192-3p抑制HBV感染原代肝細胞誘導的自噬
第四章 總結與討論
參考文獻
攻博期間發(fā)表的科研成果
致謝



本文編號：3727202