本文關鍵詞：Furin和PCSK6對類風濕性關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞生物學功能的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是以滑膜慢性炎癥、關節(jié)軟骨和骨的破壞為特點的一種系統(tǒng)性疾病�；ひr里層的成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)在RA的發(fā)病中起到了關鍵作用。弗林蛋白酶(furin)是前體蛋白轉化酶(proprotein convertases, PCs)家族的重要成員之一,參與多種活性肽前體的活化過程。且furin在RA的滑膜翳和FLS中呈現(xiàn)出高表達。我們的論文著重研究furin對RA的FLS生物學功能的影響。另外,枯草桿菌樣蛋白原轉化酶(proprotein convertase subtilisin/kexin type 6, PCSK6)也是PC家族成員之一,在RA的滑膜中也表型出高表達,我們同時也研究了PCSK6在RA的FLS中的作用,以分析兩者的作用是否相似。中文論文分為四個部分：第一部分為綜述：類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞；第二部分為綜述：弗林蛋白酶furin——胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生：第三部分：抑制furin表達對類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響；第四部分：抑制PCSK6對類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響。第一部分類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞RA是一種以關節(jié)滑膜炎癥和關節(jié)軟骨的破壞為特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病,目前在臨床上雖然治療手段很多,但仍沒有特異性的治愈方法。RA的發(fā)病機制極其復雜,包含許多類型細胞的參與：T細胞、B細胞、巨噬細胞和FLS。分布于滑膜襯里層的FLS通過分泌多種介質,包括細胞因子、化學因子、生長因子和其他的一些促炎性分子如前列腺素和白介素等,在炎癥的發(fā)生、維持、關節(jié)軟骨破壞過程中到起關鍵作用。RA的FLS可以表現(xiàn)出一些腫瘤細胞的特性,可能與P53基因功能的失活有關,產生獨特的侵襲性表型,使其能夠侵襲細胞外基質,進一步加劇關節(jié)損傷。FLS是RA發(fā)病過程中的關鍵因子之一。最近針對FLS的生物學研究進展包括它對固有免疫的調節(jié)、細胞內信號通路的調節(jié)等。對FLS的深入研究可以發(fā)現(xiàn),FLS可以作為RA患者的一個新的治療靶點,從而完善目前RA的治療。第二部分弗林蛋白酶furin-——胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生弗林蛋白酶furin在體內介導了一個簡單的生化反應,催化前體蛋白水解為成熟蛋白。雖然這個反應看似簡單,furin生理作用卻極其重要。它參與了人體內的多種生理過程,是維持人體穩(wěn)態(tài)平衡的重要分子。與furin相關的疾病相當廣泛,包括：阿爾茨海默病、腫瘤、炭疽和埃博拉出血熱等等。本篇綜述主要概括了furin的結構、活性、細胞內定位、細胞內轉運、作用底物、生物學特性以及與胚胎發(fā)生和多種疾病的關系。第三部分抑制furin表達對類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響研究背景類風濕性關節(jié)炎RA是以滑膜慢性炎癥、關節(jié)軟骨和骨的破壞為特點的一種系統(tǒng)性疾病。在RA中,正�；南鄬Φ撵o止狀態(tài)轉變?yōu)榫哂性鲋承院颓忠u性的滑膜翳組織。RA的發(fā)病機制非常復雜,多種細胞類型參與其中,如淋巴細胞、巨噬細胞和滑膜細胞。其中,滑膜襯里層的FLS在RA的發(fā)病中起到了關鍵作用。FLS分泌一系列細胞因子、炎性介質以及多種蛋白水解酶,介導局部的炎癥反應,以及參與降解細胞外基質和軟骨蛋白。RA患者來源的FLS的生物學特性不同于健康個體或骨性關節(jié)炎患者。這些炎性滑膜來源的滑膜細胞表現(xiàn)出一些轉化細胞的表型特征,如細胞的錨定不依賴性生長、過度增殖、細胞侵襲、以及對凋亡誘導的耐受等。在體外培養(yǎng)此類細胞時,這些滑膜細胞在沒有T細胞存在的情況下仍然可以長時間保持其侵襲力和破壞力。說明RA的關節(jié)破壞除了T細胞參與的自身免疫調節(jié)等機制,也有不依賴T細胞的以FLS為中心的機制。這類滑膜細胞是關節(jié)自分泌/旁分泌調控網(wǎng)絡中的關鍵因子,加重關節(jié)滑膜慢性炎性狀態(tài)和關節(jié)破壞。RA的最近的一些治療進展主要集中于針對炎性細胞因子和淋巴細胞免疫的生物治療,如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)抑制劑,T細胞共刺激信號抑制劑,和B細胞清除劑等。在部分患者中這些生物治療是有效的。但仍有很大一部分患者對以上這些生物制劑沒有應答。因此,尋找新的治療靶點,尤其是針對RA的FLS的治療可能會完善現(xiàn)有治療方案。Furin是PCs家族的重要成員之一,廣泛分布于機體各種細胞中。Furin主要位于細胞內高爾基體外側網(wǎng)絡(trans-Golgi network, TGN),并在高爾基體外側網(wǎng)絡和細胞膜之間循環(huán)轉運。Furin能夠通過識別、剪切特定序列Arg-Xaa-(Lys/Arg)-Arg,水解多種前體蛋白,這一剪切過程是多種蛋白成熟活化的關鍵步驟,對蛋白質的功能起到重要的調節(jié)作用。最近的研究表明,furin參與了胚胎發(fā)育、機體穩(wěn)態(tài)和多種疾病發(fā)生發(fā)展等過程。然而在生殖細胞中敲除furin會使胚胎死亡,因此furin在各種細胞中的作用缺乏基因敲除動物這種有利的研究手段。既往有實驗發(fā)現(xiàn)RA患者的關節(jié)滑膜翳中furin的表達明顯增加,但機制和作用尚不明了。Furin表達的上調可能會促進關節(jié)滑膜炎癥,也可能是滑膜對炎癥反應或自身免疫時的一種代償。因此,研究滑膜細胞上高表達的furin的作用是一個亟需解決的課題。為了研究這個課題,我們設計了一系列實驗。將RA患者來源的FLS進行體外培養(yǎng),將其高表達的furin使用RNA干擾技術進行基因抑制,研究抑制furin對滑膜細胞增殖、侵襲、遷移、細胞周期、細胞凋亡、分泌炎癥因子的影響。從而證明furin在滑膜細胞生物學功能中的作用。研究目的探索RA患者FLS細胞上高表達的furin對細胞的生物學功能的影響。研究方法我們從RA患者行膝關節(jié)置換術后的滑膜組織中消化分離FLS進行體外培養(yǎng),瞬時轉染小干擾RNA抑制細胞內furin表達,并設置對照組小干擾RNA,驗證siRNA-furin的干擾效率。進一步的研究使用兩組furin差異表達的FLS進行以下功能學實驗：(1)MTT細胞增殖實驗；(2)Transwell細胞侵襲實驗；(3)單層細胞劃痕實驗；(4)細胞周期分析；(5)細胞凋亡分析；(6)酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測FLS分泌白細胞介素(interleukin, IL)IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17和TNF-a水平。研究兩組細胞在增殖、侵襲、遷移、凋亡、分泌等生物學功能中的差異。結果我們利用siRNA-furin或siRNA-control干擾RA患者的FLS上furin的表達,研究其功能差別。得到以下結果：(1) siRNA-furin在mRNA水平和蛋白水平均有效抑制FLS的furin表達。(2)RA滑膜來源的FLS上furin表達的下調增強FLS細胞的增殖、侵襲和遷移能力；(3)抑制furin表達加速FLS的細胞周期；(4)抑制furin表達影響FLS的凋亡,晚期凋亡和壞死細胞減少；(5)抑制furin的表達使FLS分泌TNF-a和IL-1β增加；結論(1)抑制RA滑膜FLS細胞上furin的表達增強了FLS細胞的增殖、侵襲、遷移和分泌炎癥因子等功能；(2)RA滑膜細胞上furin的高表達可能是一種代償性反應,抑制滑膜細胞的增殖、侵襲、遷移等表型；(3) Furin在循環(huán)和局部的作用不盡相同,具體機制有待進一步研究。研究意義RA是一種高度異質性疾病,炎癥、免疫、代謝等多個方面參與其發(fā)病機制。毫無疑問,關節(jié)滑膜襯里層的FLS是疾病的關鍵因子之一。我們發(fā)現(xiàn),抑制RA滑膜細胞上高表達的furin基因會增強細胞的增殖、侵襲、遷移和分泌炎癥因子的能力。因此furin可能會作為RA的治療靶點之一從而完善現(xiàn)有治療。第四部分抑制PCSK6對類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響類風濕性關節(jié)炎RA是以滑膜慢性炎癥、關節(jié)軟骨和骨的破壞為特點的一種系統(tǒng)性疾病。RA來源的FLS表現(xiàn)出類似轉化細胞的侵襲特性,通過分泌一系列細胞因子、炎性介質以及多種蛋白水解酶,介導局部的炎癥反應,參與降解細胞外基質和軟骨蛋白,加重RA的關節(jié)損害。PCSK6是一種Ca2+依賴的絲氨酸蛋白水解酶,參與多種肽的活化過程。既往研究顯示PCSK6具有增強腫瘤細胞侵襲性和增值能力的作用。而且與骨性關節(jié)炎相比,PCSK6在RA滑膜上表達增高。因此我們設計一系列實驗研究PCSK6對RA來源的FLS生物學功能的影響。研究目的探索RA患者FLS細胞上PCSK6的表達對細胞的生物學功能的影響。方法和結果我們從RA患者行膝關節(jié)置換術后的滑膜組織中消化分離FLS進行體外培養(yǎng),應用siRNA轉染FLS細胞抑制PCSK6表達,并行qRT-PCR和Western blot檢測驗證PCSK6在mRNA和蛋白水平表達的降低。細胞轉染后進行的功能學實驗包括：(1)MTT細胞增殖實驗,證明抑制RA FLS細胞PCSK6表達降低細胞的增殖能力；(2)Transwell細胞侵襲實驗,證明降低RA FLS細胞PCSK6表達抑制FLS細胞的侵襲能力；(3)單層細胞劃痕實驗,證明抑制]PCSK6表達后RA FLS細胞遷移能力降低；(4)ELISA檢測FLS分泌功能,證明抑制]PCSK6的表達使RA FLS分泌TNF-α水平降低。結論(1)抑制PCSK6的表達降低了RA滑膜FLS細胞的增殖、侵襲、遷移和分泌炎癥因子等功能；(2)RA滑膜細胞上高表達的PCSK6可能通過促進FLS的增殖、侵襲、遷移等加速RA的關節(jié)損害；(3) PCSK6和furin雖然同屬PCs家族,但對RA FLS細胞生物學功能的影響不同,具體機制有待進一步研究。研究意義PCSK6和furin雖然同屬PCs家族,但在RA的關鍵致病因子之一FLS細胞的生物學功能中的影響卻不同。其中涉及的發(fā)病機制極其復雜。需要我們的進一步研究。因此PCs家族可能成為RA的新的研究熱點,以期在RA的發(fā)病機制和治療中尋找關鍵靶點。
【關鍵詞】：類風濕性關節(jié)炎 furin 成纖維樣滑膜細胞 RNA干擾
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R593.22
【目錄】：

• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-17
• 符號說明17-19
• 第一部分 綜述 類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞19-31
• 參考文獻28-31
• 第二部分 綜述 弗林蛋白酶furin——胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生31-41
• 參考文獻37-41
• 第三部分 抑制furin表達對類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響41-73
• 前言41-44
• 材料與方法44-57
• 結果57-63
• 討論63-67
• 結論67-68
• 研究意義68-69
• 參考文獻69-73
• 第四部分 抑制PCSK6對類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響73-83
• 前言73-75
• 方法和結果75-77
• 討論77-79
• 結論79-80
• 研究意義80-81
• 參考文獻81-83
• 致謝83-84
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄84-85
• 學位論文評閱及答辯情況表85-86
• 發(fā)表英文論文186-107
• 發(fā)表英文論文2107-121
• 發(fā)表英文論文3121-135

【共引文獻】

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  本文關鍵詞：Furin和PCSK6對類風濕性關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞生物學功能的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：349742