目的:研究TRIM28在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過程中的作用及分子機(jī)制。方法:1、細(xì)胞培養(yǎng):正常結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞NCM460、結(jié)直腸癌細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞用含有10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境:37℃,5%CO2。2、質(zhì)粒構(gòu)建:從HEK293T的c DNA中PCR擴(kuò)增目的基因的全長c DNA,利用重組的方法將其插入克隆載體。將靶向目的基因的sh RNA序列插入PLKO.1載體,構(gòu)建敲減質(zhì)粒。所有質(zhì)粒均經(jīng)過DNA測序來保證質(zhì)粒序列正確。3、轉(zhuǎn)染和si RNA干擾:利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000按照生產(chǎn)商說明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和si RNA干擾。4、慢病毒轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建:利用HEK293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝,收集48小時或72小時含有慢病毒的上清培養(yǎng)基。利用polybrene（8μg/ml）將慢病毒轉(zhuǎn)染Lo Vo,HCT116,SW48細(xì)胞,24小時后換液,用嘌呤霉素（1μg/ml）壓力篩選一周后檢測慢病毒轉(zhuǎn)染效果。5、蛋白印記實驗:用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì),利用BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。將蛋白樣在98℃中煮10分鐘后等... 

【文章來源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：98 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
英文縮略詞表
前言
    參考文獻(xiàn)
中文摘要
ABSTRACT
材料和方法
實驗結(jié)果
    第一章 TRIM28 敲低促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移
    第二章 TRIM28與CARM1 結(jié)合并通過CARM1 抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移
    第三章 TRIM28 通過與CARM1 蛋白相互結(jié)合抑制CARM1 蛋白泛素化降解以及結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移
    第四章 TRIM28 通過CARM1 抑制WNT/β-catenin通路從而影響結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移
    第五章 TRIM28/CARM1 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義
討論
參考文獻(xiàn)
綜述:TRIM家族研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
附錄
    攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文
    攻讀博士學(xué)位期間參與課題
致謝



本文編號：3350405