目的:沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Silencing information regulator 1,SIRT1）是影響腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)分子,但關(guān)于SIRT1在腫瘤（包括卵巢癌）中發(fā)揮促癌作用抑或抑癌作用至今仍存在爭議。早在十幾年前,就有文獻(xiàn)報(bào)道SIRT1存在核-質(zhì)穿梭過程,但對于SIRT1的亞細(xì)胞定位在卵巢癌中的作用目前仍知之甚少。本研究的目的是探討SIRT1亞細(xì)胞定位對卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性和遷移侵襲的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法:1.通過構(gòu)建具有野生型SIRT1、核輸出序列（Nuclear Export Sequences,NESs）突變型SIRT1(SIRT1^NESmt)和核定位序列（Nuclear Localization Sequences,NLSs）突變型SIRT1(SIRT1^NLSmt)編碼序列的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染人類卵巢癌IGROV1細(xì)胞和HEY細(xì)胞,通過篩選獲得過表達(dá)野生型SIRT1、NESs突變型SIRT1和NLSs突變型SIRT1的卵巢癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(以下簡稱為SIRT1細(xì)胞、SIRT1^NESmt細(xì)胞和S... 

【文章來源】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)陜西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：117 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

熒光顯微鏡下觀察對照組（Con136）中的GFP以及SIRT1細(xì)胞、SIRT1NESmt細(xì)胞和SIRT1NLSmt細(xì)胞中的SIRT1-GFP融合蛋白

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文-45-圖1.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中外源性SIRT1表達(dá)檢測（A、B）顯示通過real-timePCR檢測IGROV1系列細(xì)胞和HEY系列細(xì)胞中SIRT1mRNA相對表達(dá)水平（n=3；ns，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05，均與Con136比較）。（C、D）顯示W(wǎng)esternblot對各組細(xì)胞中SIRT1水平的檢測。SIRT1表示細(xì)胞內(nèi)源性SIRT1，SIRT1-GFP代表外源性SIRT1；Actin用作衡量各組中蛋白上樣量的內(nèi)參蛋白。Figure1.2DetectionofSIRT1expressioninstablytransfectedcellsSIRT1mRNAlevelsmeasuredbyreal-timePCRinIGROV1andHEYcellgroups(parentalcells,Con136,SIRT1,SIRT1NESmtandSIRT1NLSmtcells)wereshownin(A)and(B).Eachbarrepresentedthemean±SD(n=3;ns,notsignificant;***,P<0.001;**,P<0.01;*,P<0.05).ProteinlevelsofendogenousSIRT1andexogenousSIRT1-GFPdeterminedbyWesternblotanalyseswereshownin(C)and(D).Actinwasusedastheloadingcontrol.接下來我們分離提取各組細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核組分，進(jìn)行了Westernblot檢測，以進(jìn)一步確定NESs序列和NLSs序列突變是否能夠影響外源性SIRT1的表達(dá)，影響其亞細(xì)胞的分布。從圖1.3中Westernblot檢測結(jié)果可以看出，SIRT1NESmt細(xì)胞中SIRT1-GFP的胞

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文-46-核分布顯著增加，符合我們設(shè)計(jì)之初的預(yù)想，即通過突變核輸出序列限制SIRT1出核，以達(dá)到提高其胞核定位的目的。SIRT1NLSmt細(xì)胞中SIRT1-GFP的胞核分布顯著減少，絕大多數(shù)集中于胞質(zhì)中，也提示我們通過核定位序列突變，阻礙了SIRT1向核內(nèi)的運(yùn)輸，從而使其在細(xì)胞質(zhì)中富集。上述結(jié)果顯示，我們的構(gòu)建策略有效地影響了SIRT1的核-質(zhì)穿梭，獲得了過表達(dá)不同亞細(xì)胞定位SIRT1的卵巢癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。圖1.3卵巢癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞核組分中內(nèi)源性SIRT1和外源性SIRT1-GFP的表達(dá)情況Tubulin和LaminB分別用作細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的內(nèi)參蛋白。Figure1.3SIRT1expressionincytoplasmicandnuclearextractsfromparentalcells,Con136,SIRT1,SIRT1NLSmtandSIRT1NLSmtcellsTubulinandlaminBwereusedasthecytoplasmicandnuclearloadingcontrols,respectively.3.2各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞SIRT1去乙�；腹δ艿臋z測及比較由于SIRT1是去乙�；�，我們在改變其亞細(xì)胞定位的同時應(yīng)確保其去乙�；傅墓δ懿皇苡绊�，如果以損害其酶活性為代價(jià)改變亞細(xì)胞定位，勢必會大大減弱我們研究的意義，于是我們設(shè)法對各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中SIRT1的去乙�；富钚赃M(jìn)行了評估。p53是SIRT1去乙�；饔玫囊阎蟹肿�，其382位賴氨酸殘基（lys382，K382）的乙�；癄顟B(tài)可以被SIRT1解除，因此比較K382位點(diǎn)乙�；痯53（Ac-K382p53）的水平可以相對衡量各組細(xì)胞間外源性SIRT1的去乙�；富钚�。但p53作為促凋亡蛋白，在正常情況下其本底水平較低且半衰期短，當(dāng)細(xì)胞遭遇細(xì)胞毒性或DNA損傷事件時，其表達(dá)水平和乙�；矫黠@增加，阻斷細(xì)胞周期，促使細(xì)胞進(jìn)行損傷修復(fù)，或者進(jìn)入細(xì)胞死亡的程序。因此，我們對IGROV1的各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞給予了順鉑處理，以誘導(dǎo)p53的表達(dá)和乙�；降脑�


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