目的:了解牛膝多肽加入不同時間后對原代培養(yǎng)及在體坐骨神經(jīng)缺損修復(fù)時施萬細(xì)胞增殖功能的促進(jìn)作用,并探討牛膝多肽促施萬細(xì)胞增殖過程的作用機(jī)制及關(guān)鍵調(diào)控基因,進(jìn)一步研究牛膝多肽對施萬細(xì)胞的整體作用及機(jī)制分析,有助于周圍神經(jīng)損傷治療靶點的探尋,為牛膝多肽用于臨床治療周圍神經(jīng)損傷提供更有針對性的思路。方法:1.體外培養(yǎng)原代施萬細(xì)胞。分別加入完全培養(yǎng)基（Control組）、含牛膝多肽的完全培養(yǎng)基（ABPPk組）、含NGF的完全培養(yǎng)基（NGF組）,分別于加入后不同時間點（15min、0.5h、1h、2h、3h、6h、12h、24h）,通過 CCK8、細(xì)胞周期檢測、EdU增殖檢測、細(xì)胞增殖核抗原（PCNA、Ki67）的蛋白及免疫熒光檢測等方法確定施萬細(xì)胞的增殖變化。2.制備大鼠坐骨神經(jīng)夾傷模型。大鼠坐骨神經(jīng)夾傷后,分別在損傷神經(jīng)外膜下顯微注射生理鹽水（Control組）、含牛膝多肽的生理鹽水（ABPPk組）、含NGF的生理鹽水（NGF組）,于術(shù)后不同時間點（1d、4d、7d）取大鼠損傷段坐骨神經(jīng),通過Western blot及冰凍切片-免疫組化-光鏡觀察施萬細(xì)胞增殖情況及神經(jīng)形態(tài)變化。3.全轉(zhuǎn)錄組測序... 

【文章來源】：蘇州大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：100 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１．施萬細(xì)胞培養(yǎng)圖

牛膝多肽促施萬細(xì)胞增殖作用及機(jī)制研宄?結(jié)果??為了鑒定施萬細(xì)胞純度，采用施萬細(xì)胞特異性標(biāo)記Ｓ１００進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化??學(xué)染色，Ｈ〇ｅｃｈＳｅ３３３４２標(biāo)記細(xì)胞核。標(biāo)記結(jié)果顯示，純化后大部分施萬細(xì)胞呈現(xiàn)??Ｓ１００陽性。結(jié)果提示，體外培養(yǎng)的施萬細(xì)胞純度較高，可達(dá)９５％以上，可用于后??續(xù)細(xì)胞實驗（圖２）。??Ｈ＾ＩＨＩ??圖２．施萬細(xì)胞免疫熒光鑒定。綠色為ＳＩＯＯ染色的施萬細(xì)胞，藍(lán)色為??Ｈｏｅｃｈｓｅ３３３４２染色的細(xì)胞核，Ｍｅｒｇｅ為兩者共同標(biāo)記的部分。Ｂａｒ＝５０ｐｍ。??２．?ＡＢＰＰｋ對正常培養(yǎng)施萬細(xì)胞活力的影響??采用Ｃ＇ＣＫ－８法觀察ＡＢＰＰｋ處理不同時間對正常培奍施萬細(xì)胞活力的影響。??分別給予〇．５Ｈｇ／ｍｌ?ＡＢＰＰｋ及Ｏ．ｌｐｇ／ｍｌ?ＮＧＦ處理施萬細(xì)胞不同時間，ＤＭＥＭ完全??培養(yǎng)基為陰性對照組，培養(yǎng)不同時間（１５ｍｉｎ，?０．５ｈ，ｌｈ，?２ｈ，３ｈ，６ｈ，．．１２ｈ，２４ｈ）??進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ＡＢＰＰｋ及ＮＧＦ處理不Ｍ時間后對正常施萬細(xì)胞活??力有不同程度的增殖影響（圖３）。??２．０－，??ｔ?ＥＳ３?Ｃｏｎｔｒｏｌ??百?＊＊?＊?，?＊?＊?＊?，?＊?＊?ＥＥ３?ＡＢＰＰｋ?０．５［ｊｇ／ｍｌ??＾?１５＂?ｗ?＾?＊｜?Ｘ?：?＇?ｉ?：?＾?□?ＮＧＦ?０．１ｐｇ／ｍｌ??５１．０－?Ｊ；?ｉ：?ｊ１１：：?＾?｜ｎ?ｉｎ??！〇ｌ?ｈ?ｉｈｌｉｎｌ！??＾?＾?＾?＾?＾?ｎｆ??圖３．?ＡＢＰＰｋ及ＮＧＦ對施萬細(xì)胞的活力的影響（＊ｐ＜０．０５）。??１９??

牛膝多肽促施萬細(xì)胞增殖作用及機(jī)制研宄?結(jié)果??為了鑒定施萬細(xì)胞純度，采用施萬細(xì)胞特異性標(biāo)記Ｓ１００進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化??學(xué)染色，Ｈ〇ｅｃｈＳｅ３３３４２標(biāo)記細(xì)胞核。標(biāo)記結(jié)果顯示，純化后大部分施萬細(xì)胞呈現(xiàn)??Ｓ１００陽性。結(jié)果提示，體外培養(yǎng)的施萬細(xì)胞純度較高，可達(dá)９５％以上，可用于后??續(xù)細(xì)胞實驗（圖２）。??Ｈ＾ＩＨＩ??圖２．施萬細(xì)胞免疫熒光鑒定。綠色為ＳＩＯＯ染色的施萬細(xì)胞，藍(lán)色為??Ｈｏｅｃｈｓｅ３３３４２染色的細(xì)胞核，Ｍｅｒｇｅ為兩者共同標(biāo)記的部分。Ｂａｒ＝５０ｐｍ。??２．?ＡＢＰＰｋ對正常培養(yǎng)施萬細(xì)胞活力的影響??采用Ｃ＇ＣＫ－８法觀察ＡＢＰＰｋ處理不同時間對正常培奍施萬細(xì)胞活力的影響。??分別給予〇．５Ｈｇ／ｍｌ?ＡＢＰＰｋ及Ｏ．ｌｐｇ／ｍｌ?ＮＧＦ處理施萬細(xì)胞不同時間，ＤＭＥＭ完全??培養(yǎng)基為陰性對照組，培養(yǎng)不同時間（１５ｍｉｎ，?０．５ｈ，ｌｈ，?２ｈ，３ｈ，６ｈ，．．１２ｈ，２４ｈ）??進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ＡＢＰＰｋ及ＮＧＦ處理不Ｍ時間后對正常施萬細(xì)胞活??力有不同程度的增殖影響（圖３）。??２．０－，??ｔ?ＥＳ３?Ｃｏｎｔｒｏｌ??百?＊＊?＊?，?＊?＊?＊?，?＊?＊?ＥＥ３?ＡＢＰＰｋ?０．５［ｊｇ／ｍｌ??＾?１５＂?ｗ?＾?＊｜?Ｘ?：?＇?ｉ?：?＾?□?ＮＧＦ?０．１ｐｇ／ｍｌ??５１．０－?Ｊ；?ｉ：?ｊ１１：：?＾?｜ｎ?ｉｎ??！〇ｌ?ｈ?ｉｈｌｉｎｌ！??＾?＾?＾?＾?＾?ｎｆ??圖３．?ＡＢＰＰｋ及ＮＧＦ對施萬細(xì)胞的活力的影響（＊ｐ＜０．０５）。??１９??


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