第一部分aPKCι促進Nrf2蛋白累積并抑制膽囊癌細胞內(nèi)ROS水平目的:研究在正常條件下和氧化應(yīng)激狀態(tài)下aPKCι對膽囊癌細胞內(nèi)ROS水平的調(diào)節(jié)作用,初步探討aPKCι與Nrf2蛋白表達的相關(guān)性。方法:構(gòu)建aPKCι過表達和靶向沉默的慢病毒載體,分別感染膽囊癌細胞NOZ和GBC-SD以獲得穩(wěn)定細胞株。采用western blot和qRT-PCR方法檢測各組穩(wěn)定細胞中aPKCι的蛋白質(zhì)和m RNA表達水平。采用DCFH-DA探針法檢測不同aPKCι表達水平或吉西他濱處理后的膽囊癌細胞內(nèi)ROS水平的變化。檢測aPKCι激酶抑制劑PSI對aPKCι活性和Nrf2蛋白水平的影響。構(gòu)建攜帶Flag標簽的激酶失活型（KI）、持續(xù)激活的催化結(jié)構(gòu)域（CAT）突變體,采用western blot方法檢測各組細胞中總Nrf2蛋白和磷酸化Nrf2蛋白的表達。再運用western blot和qRT-PCR方法檢測aPKCι對Keap1、Nrf2及其下游靶基因表達的影響。分別提取各組穩(wěn)定細胞中的漿蛋白與核蛋白,檢測aPKCι、Keap1、Nrf2蛋白在細胞漿、細胞核內(nèi)的分布。在aPKCι過表達膽囊癌細胞中靶向沉... 

【文章來源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

A-B：DCFH-DA法檢測膽囊癌細胞內(nèi)ROS水平的變化，**P<0.01

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文式—磷酸化 aPKC （p-aPKC ） 的表達水平逐漸降低，而總 aPKC （T-aPKC ）表達水平無明顯變化。此外，我們還發(fā)現(xiàn) p-Nrf2 和 T-Nrf2 亦無明顯變化。但是，Ect2—一種 aPKC 的底物[18, 19]—磷酸化水平（p-Ect2）被抑制，且總 Ect2（T-Ect2）無明顯改變。這表明本研究中 PSI 的確抑制了 aPKC 的激酶活性（圖 1-3-C）。為了進一步證實 aPKC 調(diào)控 Nrf2 蛋白富集是否與其激酶活性有關(guān)，我們構(gòu)建了攜帶 Flag 標簽的 aPKC 野生型（wide type, WT）、激酶失活型（kinase-inactive，KI）、持續(xù)激活的催化結(jié)構(gòu)域（constitutively active catalytic domain，CAT）載體轉(zhuǎn)染至膽囊癌細胞。WB 檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，WT、KI 及 CAT組細胞中p-Nrf2蛋白顯影仍然微弱且無明顯變化，而T-Nrf2蛋白則升高（圖1-3-D，E）。因此，上述結(jié)果表明 aPKC 可能以非激酶依賴的方式參與調(diào)控抗氧化反應(yīng)。

圖 1-4.A：Western blot 檢測 aPKC 對 Nrf2、Keap1 蛋白表達的影響。B：qRT-PCR 檢測 aPKC 對 Nrf2、Keap1 mRNA 表達的影響。C：Western blot 檢測 aPKC 對 Nrf2、Keap1 蛋白在細胞漿/核內(nèi)分布的影響。D：qRT-PCR檢測aPKC 對Nrf2靶基因mRNA水平的影響，*P<0.05，**P<0.01。5. aPKCι 通過 Nrf2 介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激信號調(diào)控膽囊癌細胞內(nèi)的 ROS 水平接下來，我們繼續(xù)研究 aPKC 是否通過 Nrf2 介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)調(diào)控膽囊癌細胞內(nèi) ROS 水平。首先我們篩選了敲低內(nèi)源性 Nrf2 的 siRNA 序列，并經(jīng) WB驗證靶向沉默 Nrf2 的有效性（圖 1-5-A）。然后將陰性對照 siRNA（si-neg）與si-Nrf2 分別轉(zhuǎn)染至過表達 aPKC 的膽囊癌細胞。采用 DCFH-DA 法檢測細胞內(nèi)ROS 水平的變化。結(jié)果顯示，抑制 Nrf2 表達后，完全逆轉(zhuǎn)了過表達 aPKC 對細胞內(nèi) ROS 水平的抑制作用（圖 1-5-B）。這提示 aPKC 可能是通過 Nrf2 介導(dǎo)的抗氧化信號通路調(diào)控膽囊癌細胞內(nèi)的 ROS 水平。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]全國膽囊癌臨床流行病學(xué)調(diào)查報告[J]. 鄒聲泉,張林.  中國實用外科雜志. 2000(01)



本文編號：3316799