研究背景和目的一氧化氮（NO）是一種性質(zhì)活躍的氣體信號分子,發(fā)揮血管舒張、突觸傳遞及免疫防御等多種生理功能。目前的研究還發(fā)現(xiàn)NO與腫瘤關系密切,調(diào)控腫瘤的起始、轉移、耐藥和免疫逃逸等一系列過程。內(nèi)源性的NO主要由三種一氧化氮合酶（NOS）催化生成。其中NOS1和NOS3為組成型表達,合成低濃度的NO;而NOS2為誘導性型表達,合成高濃度的NO。不同的NOS產(chǎn)生NO的濃度及持續(xù)時間不同,決定了其生物學效應的不同。近年來越來越多的研究表明,不同NOS的亞細胞定位也是決定其功能的重要因素之一。目前發(fā)現(xiàn)不同的NOS亞型可以定位于細胞膜、溶酶體、高爾基體及細胞核等不同的亞細胞結構中。既往已經(jīng)有研究顯示NO參與了結腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉移等一系列過程,但NOS1在結腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用目前尚未見報道。本研究的主要目的是探討NOS1是否通過其特殊的亞細胞定位參與結腸癌的進展。研究結果1.NOS1定位于結腸癌細胞線粒體:分析TCGA數(shù)據(jù)庫顯示NOS1表達量與結直腸腺癌患者的臨床分期呈負相關,并且NOS1高表達提示預后較差。為了深入研究NOS1對結腸癌的影響,我們構建了穩(wěn)定過表達NOS1的結腸癌細胞株。應用... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學廣東省

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１?ｍｔＮＯＳ對線粒體功能的影響??Ｆｉ．?１?Ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ｍｔＮＯＳ?ｏｎ?ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ?ｆｌｉｎｃｔｉｏｎ??

篩選陽性細胞。最后用Ｑ－ＰＣＲ和蛋白免疫印跡法分別從ｍＲＮ?Ａ和蛋白水平驗證對??照組（ＮＣ）與過表達Ｎ０Ｓ１組（ＯＥ－ＮＯＳ１）結腸癌細胞株中Ｎ０Ｓ１的表達情況。??結果顯示０Ｅ－Ｎ０Ｓ１結腸癌細胞Ｎ０Ｓ１的ｍＲＮＡ和蛋白表達均有顯著升高（圖１－２）。??以上結果說明過表達Ｎ０Ｓ１的結腸癌細胞株構建成功。??Ａ?＞５?１＾］?丁?８?ＮＣ?０Ｅ－Ｎ０Ｓ１??§?ｓｏ－?ｎｏｓｉ?｜?—??ｇａｐｏｈ??｜Ｅ?５〇１?■?：：＾——??？?５?５－ｒ??■??■??〇ｉ?ｍ??ＮＣ?ＯＥ－ＮＯＳ１??圖１－２構建過表達ＮＯＳＩ的結腸癌細胞株??（Ａ）?Ｑ－ＰＣＲ檢測ＮＯＳ１的ｍＲＮＡ的表達；（Ｃ）?ＷＢ檢測ＮＯＳ１蛋白的表達；??Ｆｉｇ．?１－２?Ｃｏｌｏｎ?ｃａｎｃｅｒ?ｃｅｌｌ?ｌｉｎｅｓ?ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ?ＮＯＳＩ?ｗｅｒｅ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ??（Ａ）?ＮＯＳＩ?ｍＲＮＡ?ｉｎ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ｃｅｌｌｓ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｄｃｔｅｄ?ｂｙ?Ｑ－ＰＣＲ；?（Ｂ）?ＮＯＳＩ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎ??ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ｃｅｌｌｓ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｄｃｔｅｄ?ｂｙ?ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ．??第３節(jié)提取細胞線粒體，觀察ＮＯＳＩ在線粒體的定位??為了驗證ＮＯＳ１是否在定位于線粒體內(nèi)

異性標記物Ｍｉｔｏｔｒａｋｅｒ－ＲＥＤ標記線粒體，使線粒體帶有紅色熒光，使用綠色熒光??蛋白（ＧＦＰ）標記Ｎ０Ｓ１蛋白。我們在共聚焦顯微鏡下清晰地觀察到Ｎ０Ｓ１（綠色??熒光）與線粒體（紅色熒光）存在共定位關系（重疊后呈現(xiàn)黃色）（圖１－４）。此結果進??一步表明Ｎ０Ｓ１在結腸癌細胞線粒體內(nèi)表達。??■■ＭＭ?，，??Ｉ?ｓｏ．?＾?＾??１Ｗ??ＮＯＳｌ?Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ?Ｍｅｒｇｅ?＾??圖１＿４共聚焦顯微鏡觀察線粒體與Ｎ０Ｓ１的共定位關系。??Ｆｉｇ．?１－４?Ｔｈｅ?ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ?ａｎｄ?ＮＯＳｌ?ｗａｓ?ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ?ｂｙ?ｃｏｎｆｏｃａｌ??ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．??第５節(jié)過表達ＮＯＳｌ增加線粒體內(nèi)一氧化氮含量??ＮＯＳ１是一種鈣離子依賴性一氧化氮合酶，而線粒體內(nèi)的鈣離子濃度較高。??因此我們推測，線粒體內(nèi)ＮＯＳ?１蛋白表達的增加會提高線粒體內(nèi)一氧化氮的含量，??進而影響線粒體生物學功能。由于一氧化氮是一種不穩(wěn)定的氣體分子，我們通??過檢測其下游代謝物亞硝酸／硝酸鹽以反映ＮＯ水平。結果顯示過表達Ｎ０Ｓ１??（０Ｅ－Ｎ０Ｓ１）明顯增加線粒體內(nèi)亞硝酸／硝酸鹽含量（圖１－５）。該結果進一步證??明ＮＯＳ?１在線粒體內(nèi)表達，并增加了線粒體內(nèi)ＮＯ水平。??３０??


本文編號：3249799