研究背景過(guò)繼細(xì)胞免疫治療（adoptive cell immunotherapy,ACT）是腫瘤免疫治療非常有潛力的治療手段�；贑AR修飾的T細(xì)胞（chimeric antigen receptor engineered T cell,CAR-T）的ACT是近年來(lái)腫瘤免疫治療的新突破。臨床前和臨床研究的觀察結(jié)果顯示CAR-T在血液系統(tǒng)惡性腫瘤和部分實(shí)體瘤治療中取得了顯著療效。然而,該治療策略卻存在一些固有的局限性。CAR是由組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的,這種類型啟動(dòng)子不受外界影響而持續(xù)表達(dá),沒(méi)有組織和時(shí)空特異性。一旦CAR-T輸入患者體內(nèi),就像被打開(kāi)的“開(kāi)關(guān)”一直處于“ON”的狀態(tài),無(wú)法通過(guò)外界因素調(diào)控CAR-T細(xì)胞活性。目前,已提出若干策略來(lái)改善CAR-T安全性。其中一個(gè)策略是加入誘導(dǎo)型自殺基因開(kāi)關(guān)（iCaspase 9）,以消除輸注的T細(xì)胞。一旦被激活,這種開(kāi)關(guān)可以迅速消除90%以上的iCas9轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞。其他方法集中于通過(guò)“非致命”開(kāi)關(guān)調(diào)控T細(xì)胞活性,這對(duì)于需要長(zhǎng)期治療的患者可能是有益的。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是成人最常見(jiàn)的惡性腦瘤,也是最致命的癌癥之一。根治性手術(shù)、放療和化療后,... 

【文章來(lái)源】：鄭州大學(xué)河南省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：122 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

EGFRvIII基因結(jié)構(gòu)

vIII 基因結(jié)構(gòu)。（A）EGFRvIII 結(jié)構(gòu)示意圖。（B）質(zhì)粒 pCDH-C分測(cè)序結(jié)果。霉素最低有效濃度的結(jié)果轉(zhuǎn)導(dǎo) U87MG 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率不足 100%，需要將未被轉(zhuǎn)以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，從而能夠更高效的利用 96 孔板有限稀我們利用載體 pCDH-CMV-EGFRvIII-EF1-puro 自身具有行上述篩選過(guò)程。因此，需要先確定嘌呤霉素殺死未轉(zhuǎn)染效濃度。如圖 1.2 所示（A-F），加入嘌呤霉素 72h 后，隨胞死亡增加。圖 D（1ug/ml）細(xì)胞大部分死亡，圖 E（2，圖 F（5ug/ml）細(xì)胞也已全部死亡。因此，確定嘌呤霉素有效濃度為 2ug/ml。

FRvIII 表達(dá)的檢測(cè)及驗(yàn)證結(jié)果2ug/ml嘌呤霉素篩選后，我們進(jìn)一步采用96孔板稀釋法挑選單續(xù) 30 天的擴(kuò)大培養(yǎng)，然后對(duì)構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá) EGFRvIII 的 U8定。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：表達(dá) EGFRvIII 的 U87MG 能夠達(dá).3A-B）。Western blot 結(jié)果顯示：EGFRvIII U87MG 組和 SMM大小約為 130KD 處出現(xiàn)條帶，對(duì)照 MG63 和 U87MG 組無(wú)條系 SMMC7721 內(nèi)源性表達(dá) EGFRvIII[55]。在我們的結(jié)果中，UFRvIII 蛋白明顯高于SMMC7721 組。此外，各組在分子量大小約帶，為內(nèi)參 β-actin（圖 3C）。上述結(jié)果證明細(xì)胞株構(gòu)建成功。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]靶向抑制表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）逆轉(zhuǎn)骨肉瘤惡性生物學(xué)行為的研究[D]. 羅慶.重慶醫(yī)科大學(xué) 2010

碩士論文
[1]嵌合EGFRvⅢ scFv-CD137-CD3ζ質(zhì)粒的構(gòu)建及其所修飾T淋巴細(xì)胞的選擇性殺傷作用[D]. 黃瑩.河南大學(xué) 2013



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