p53作為一個重要的抑癌蛋白,其蛋白水平在細胞內需要受到嚴格的調控。作為體內最為關鍵的p53負調因子,E3泛素連接酶Mdm2能夠結合并催化p53發(fā)生多聚泛素化修飾,進而促使p53通過蛋白酶體途徑降解。在我們的研究中,我們鑒定了 MARCH7是Mdm2一個新的相互作用蛋白。有意思的是,和傳統(tǒng)E3泛素連接酶介導底物降解的作用不同,MARCH7作為一個E3泛素連接酶能夠穩(wěn)定Mdm2的蛋白水平。MARCH7也能夠通過穩(wěn)定Mdm2,進而促進p53多聚泛素化和蛋白降解。在分子機制上,我們發(fā)現(xiàn)MARCH7能夠在體內外特異性地催化Mdm2形成K63-依賴的多聚泛素鏈,進而抑制Mdm2的自身泛素化和降解。在功能上,MARCH7能夠通過調控p53的表達水平,從而控制細胞增殖、細胞凋亡、克隆形成以及裸鼠移植瘤生長。我們的這一工作揭示了一種全新的Mdm2蛋白穩(wěn)定性調控模式,并表明MARCH7是Mdm2-p53通路的一個重要調控因子。p53作為抑癌蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵的調控作用。雖然p53抑制腫瘤轉移的功能已被人們逐漸認識,然而其潛在的分子機制目前仍然不是很明確。在我們的另一項研究中,我們鑒定了一個... 

【文章來源】：中國科學技術大學安徽省 211工程院校 985工程院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 癌癥與健康
    1.2 p53與腫瘤
    1.3 Mdm2與腫瘤
    1.4 MARCH7研究進展
    1.5 Arp2/3復合體研究進展
    1.6 研究的內容與意義
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞及小鼠來源
        2.1.2 實驗試劑
        2.1.3 實驗儀器
        2.1.4 抗體
        2.1.5 引物
    2.2 細胞培養(yǎng)
    2.3 質粒構建
        2.3.1 目的條帶擴增
        2.3.2 瓊脂糖凝膠電泳
        2.3.3 PCR產物膠回收
        2.3.4 目的片段雙酶切及連接
        2.3.5 轉化及單克隆鑒定
        2.3.6 大腸桿菌感受態(tài)制備
        2.3.7 shRNA質粒構建
        2.3.8 Axygen質粒小量提取試劑盒抽提質粒
        2.3.9 堿法質粒粗提
    2.4 蛋白質印記
    2.5 實時熒光定量PCR
        2.5.1 總RNA提取
        2.5.2 RNA逆轉錄成cDNA
        2.5.3 實時熒光定量PCR
    2.6 質粒轉染與病毒感染
        2.6.1 質粒瞬時轉染
        2.6.2 病毒感染
    2.7 免疫共沉淀
    2.8 蛋白表達及純化
    2.9 體內外泛素化實驗
        2.9.1 體內泛素化實驗
        2.9.2 體外泛素化實驗
    2.10 熒光素酶報告基因檢測
    2.11 免疫熒光實驗
    2.12 軟瓊脂克隆形成實驗
    2.13 裸鼠成瘤實驗
    2.14 GST pull-down實驗
    2.15 染色體免疫沉淀（CHIP)實驗
    2.16 Pyrene actin聚合實驗
    2.17 Actin負染電鏡觀察
        2.17.1 Actin聚合反應
        2.17.2 負染電鏡觀察actin分支情況
    2.18 細胞遷移和細胞侵襲實驗
    2.19 單細胞追蹤實驗
    2.20 體內腫瘤轉移實驗
    2.21 數(shù)據(jù)重復性和統(tǒng)計分析
第三章 結果與討論
    第一部分 MARCH7調控Mdm2-p53信號通路
        3.1 MARCH7是Mdm2的互作蛋白
            3.1.1 MARCH7與Mdm2在體內外相互作用
            3.1.2 MARCH7與Mdm2結合的區(qū)段分析
        3.2 MARCH7增加Mdm2的蛋白穩(wěn)定性
            3.2.1 MARCH7增加野生型Mdm2蛋白水平
            3.2.2 MARCH7調節(jié)Mdm2穩(wěn)定性
        3.3 MARCH7促進Mdm2依賴的p53多聚泛素化和降解
            3.3.1 MARCH7調節(jié)Mdm2-p53信號軸
            3.3.2 MARCH7通過Mdm2調節(jié)p53多聚泛素化和降解
            3.3.3 MARCH7調節(jié)p53轉錄活性
        3.4 MARCH7催化Mdm2形成K63連接的多聚泛素化
            3.4.1 MARCH7增強Mdm2 C464A多聚泛素化
            3.4.2 MARCH7能夠促進Mdm2 K63連接的多聚泛素鏈形成
        3.5 MARCH7以p53依賴的方式調節(jié)細胞增殖、細胞凋亡和腫瘤發(fā)生
            3.5.1 MARCH7以p53依賴的方式調節(jié)細胞增殖
            3.5.2 MARCH7調控Mdm2本底水平控制p53對DNA損傷的響應
            3.5.3 MARCH7調控p53介導的細胞凋亡
            3.5.4 MARCH7調控p53介導的腫瘤發(fā)生
        3.6 討論
    第二部分 WDR63介導p53抑制腫瘤轉移
        4.1 WDR63抑制細胞遷移、細胞侵襲和腫瘤轉移
            4.1.1 WDR63抑制細胞劃痕愈合和遷移
            4.1.2 WDR63抑制細胞侵襲
            4.1.3 WDR63抑制腫瘤轉移
            4.1.4 WDR63不影響細胞增殖、凋亡和周期阻滯
        4.2 WDR63是p53直接的轉錄靶標
            4.2.1 p53正向調控WDR63的表達
            4.2.2 p53直接轉錄調控WDR63
        4.3 WDR63與Arp2/3復合體相互作用
            4.3.1 WDR63與Arp2在體內外相互作用
            4.3.2 WDR63是Arp2/3復合體的新型結合蛋白
        4.4 WDR63抑制Arp2/3介導的actin聚合
            4.4.1 WDR63抑制Arp2/3介導的actin聚合
            4.4.2 WDR63與VCA競爭結合Arp2/3復合體
        4.5 WDR63通過Arp2/3復合體抑制細胞遷移和細胞侵襲
            4.5.1 WDR63通過Arp2/3抑制細胞遷移和細胞侵襲
            4.5.2 與Arp2/3復合體結合是WDR63抑制細胞遷移和細胞侵襲必須的
        4.6 WDR6介導p53抑制細胞遷移、細胞侵襲和轉移功能
        4.7 討論
參考文獻
致謝
在讀期間發(fā)表的論文及取得的成果



本文編號：3169270