本文關(guān)鍵詞：MACC1基因表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌血管生成的影響及相關(guān)機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：研究MACC1、c-Met、微血管密度(Microvascular density, MVD)在NSCLC中的表達(dá)及相關(guān)性,探討三者與NSCLC臨床病理特征(特別是與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管生成)之間的關(guān)系；并進(jìn)一步通過雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)和NSCLC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究MACC1基因?qū)SCLC血管生成的影響及相關(guān)分子作用機(jī)制。方法：1.MACC1、c-Met、MVD在NSCLC中的表達(dá)及相關(guān)性研究,探討三者與NSCLC臨床病理特征之間的關(guān)系：收集手術(shù)切除后的NSCLC組織50例,采用免疫組織化學(xué)方法檢測癌組織和癌旁正常組織中的MACC1、c-Met、MVD (CD34標(biāo)記)表達(dá)情況,分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系及三者的相關(guān)性。2. NSCLC細(xì)胞系中MACC1的mRNA水平的測定：培養(yǎng)5株NSCLC細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)方法檢測MACC1基因在所培養(yǎng)的5株NSCLC細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平；3.沉默MACC1基因表達(dá)對(duì)NSCLC細(xì)胞促血管生成的影響及其作用機(jī)制研究：選擇MACC1基因高表達(dá)肺癌細(xì)胞系XWLC-05,使用化學(xué)合成的MACC1-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染XWLC-05細(xì)胞,經(jīng)相關(guān)檢測有效沉默細(xì)胞中MACC1基因表達(dá)的基礎(chǔ)上,分別于轉(zhuǎn)染細(xì)胞0小時(shí),24小時(shí),48小時(shí),72小時(shí)后收集培養(yǎng)細(xì)胞上清液,采用ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中血管生成相關(guān)因子VEGF, bFGF, IL8的分泌水平,于轉(zhuǎn)染72小時(shí)后收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液,通過雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)檢測各實(shí)驗(yàn)組血管生成情況,同時(shí)提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白,Western-blot方法檢測MACC1下游信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白分子Met、p-MEK/MEK、p-Erk/Erk和p-Akt/Akt的相對(duì)表達(dá)量。4.MACC1基因過表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌促血管生成的影響及其作用機(jī)制研究：搜索Genebank中人MACC1的基因序列,自Thermo Scientific公司購買MACC1 cDNA克隆質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)雙酶切后將目的基因MACC1序列克隆入帶有綠色熒光蛋白報(bào)告基因的PIRES2-EGFP表達(dá)載體,經(jīng)測序檢測成功構(gòu)建PIRES2-EGFP-MACC1表達(dá)質(zhì)粒,將已構(gòu)建成功的PIRES2-EGFP-MACC1表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人MACC1基因低表達(dá)肺腺癌細(xì)胞系SPC-A1,分別于轉(zhuǎn)染細(xì)胞0小時(shí),24小時(shí),48小時(shí),72小時(shí)后收集培養(yǎng)細(xì)胞上清液,采用ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中血管生成相關(guān)因子VEGF, bFGF, IL8的分泌水平,于轉(zhuǎn)染72小時(shí)后收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液,通過雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)檢測各實(shí)驗(yàn)組血管生成情況,同時(shí)提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白,Western-blot方法檢測MACC1下游信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白分子Met、 p-MEK/MEK、p-Erk/Erk和p-Akt/Akt的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：1.50例NSCLC組織中MACC1、c-Met陽性表達(dá)率分別為68%、64%,與相應(yīng)癌旁正常組織陽性表達(dá)率(32%,36%)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); MACC1、c-Met陽性表達(dá)在NSCLC組織中表達(dá)呈正相關(guān),與NSCLC的臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；NSCLC組織中MACC1、 c-Met陽性組MVD值高于MACC1、c-Met陰性的肺癌組織(P0.05),相關(guān)性分析得出MACC1、c-Met的表達(dá)與MVD值存在相關(guān)性(P0.05)；2. RT-qPCR顯示五株NSCLC細(xì)胞中宣威肺腺癌細(xì)胞XWLC-05 MACC1 mRNA表達(dá)水平最高,肺腺癌細(xì)胞SPC-A1 MACC1 mRNA的表達(dá)水平最低；3.化學(xué)合成的3組MACC1-siRNA均能沉默XWLC-05細(xì)胞中MACC1基因的表達(dá),選擇抑制效率最高的MACC1-siRNA3組應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),其結(jié)果提示：MACC1 siRNA轉(zhuǎn)染XWLC-05細(xì)胞后,雞胚尿膜囊實(shí)驗(yàn)顯示MACC1-siRNA干擾組雞胚尿囊膜新生血管面積較無義siRNA組及空白對(duì)照組減少(P0.05)：ELISA檢測結(jié)果顯示于48和72小時(shí)所提取細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的VEGF、bFGF和IL-8細(xì)胞因子的表達(dá)水平明顯被抑制(P0.05)；Western-blot檢測結(jié)果顯示NSCLC細(xì)胞中的Met、p-MEK和p-ERK表達(dá)水平顯著降低(P0.05),但總MEK和ERK蛋白表達(dá)無明顯差異,AKT及其磷酸化蛋白水平均未受影響。4.成功構(gòu)建PIRES2-EGFP-MACC1表達(dá)載體,經(jīng)測序鑒定序列完全正確,轉(zhuǎn)染SPC-A1細(xì)胞后熒光顯微鏡下可見清晰的綠色熒光表達(dá),RT-PCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP-MACC1的SPC-A1細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)MACC1 mRNA,與轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP (Vector)組和空白對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP-MACC1組SPC-A1細(xì)胞MACC1 mRNA的表達(dá)量明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。雞胚尿膜囊實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP-MACC1組可見稍多的血管分支,雞胚尿囊膜新生血管面積較PIRES2-EGFP (Vector)組及空白對(duì)照組相比增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；Western-Blot檢測結(jié)果顯示PIRES2-EGFP-MACC1轉(zhuǎn)染組SPC-A1細(xì)胞c-Met表達(dá)水平顯著增加,MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白因子p-MEK和p-Erk略有增加(P0.05),總MEK和Erk蛋白量沒有變化,而AKT及其磷酸化水平蛋白未受影響,ELISA結(jié)果顯示與PIRES2-EGFP (Vector)組及空白對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP-MACC1組SPC-A1細(xì)胞上清液中血管生成相關(guān)因子VEGF, bFGF和IL8的分泌水平在24小時(shí)時(shí)基本一致,但48h和72小時(shí)后上述三個(gè)因子的表達(dá)水平明顯增長(P0.05)。結(jié)論：1.NSCLC組織中MACC1、c-Met在NSCLC發(fā)生和轉(zhuǎn)移中可能起重要作用,結(jié)合臨床分期對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者病情評(píng)估及預(yù)后判斷有一定的指導(dǎo)意義。2. NSCLC組織中MACC1、c-Met的表達(dá)與MVD值存在相關(guān)性,說明MACC1、c-Met的表達(dá)可能與NSCLC的血管生成有關(guān)。3.MACC1基因能夠影響NSCLC細(xì)胞誘導(dǎo)雞胚尿膜囊微血管形成的能力,其機(jī)制可能與MACC1通過影響NSCLC細(xì)胞中的HGF/c-Met及其下游MEK/ERK信號(hào)通路,調(diào)控細(xì)胞中血管生成相關(guān)因子VEGF、bFGF和IL8等分泌有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 非小細(xì)胞肺癌 雞胚尿膜囊實(shí)驗(yàn) 小干擾RNA MEK/ErkAKT 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 英文縮寫詞表(按照英文單詞字母順序排列)7-9
• 研究背景9-17
• 研究的意義9
• 國內(nèi)外研究進(jìn)展9-13
• 存在的問題13-14
• 參考文獻(xiàn)14-17
• 技術(shù)路線圖17-18
• 全文中文摘要18-21
• Abstract21-25
• 第一部分 ：MACC1在非小細(xì)胞肺癌臨床組織樣本和相關(guān)肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況25-52
• 中文摘要25-27
• ABSTRACT27-29
• 前言29-30
• 材料與方法30-38
• 結(jié)果38-44
• 討論44-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 第二部分 siRNA沉默MACC1基因表達(dá)對(duì)人肺癌細(xì)胞促進(jìn)血管形成的影響52-85
• 中文摘要52-54
• ABSTRACT54-56
• 前言56-57
• 材料與方法57-69
• 結(jié)果69-74
• 討論74-80
• 參考文獻(xiàn)80-85
• 第三部分 過表達(dá)MACC1基因?qū)θ薔SCLC細(xì)胞促血管生成的影響85-124
• 中文摘要85-87
• ABSTRACT87-89
• 前言89
• 材料與方法89-105
• 結(jié)果105-117
• 討論117-122
• 參考文獻(xiàn)122-124
• 全文總結(jié)124-126
• 綜述126-137
• 參考文獻(xiàn)133-137
• 關(guān)于使用組織樣本開展科學(xué)研究的知情同意書137-139
• 攻讀博士期間發(fā)表的論文139-140
• 致謝140-141

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：MACC1基因表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌血管生成的影響及相關(guān)機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：312440