糖尿病是一種世界范圍內(nèi)高發(fā)的代謝性疾病,患者體內(nèi)的胰島β細胞缺失或功能障礙導致胰島素分泌不足,進而誘發(fā)慢性高血糖癥。因此,在體外產(chǎn)生大量有功能的胰島β細胞對于胰腺發(fā)育學研究和糖尿病治療至關(guān)重要。近期的研究報道了很多具有前景的研究方案,其中包括由人多能干細胞向胰島β細胞的定向分化法。通過對定向分化體系的優(yōu)化,我們獲得了大量有功能的胰島β細胞。這些細胞高表達胰島β細胞的標志基因、具有胰島素分泌囊泡的亞顯微結(jié)構(gòu)且可以感應葡萄糖濃度的變化來分泌胰島素,并且具有一定的體內(nèi)功能,因而在疾病建模、藥物開發(fā)和細胞治療等方面有廣闊的應用前景。精準的基因編輯有助于高效地構(gòu)建疾病模型。然而,在人多能干細胞中進行精準的基因編輯仍然非常耗時耗力。CRISPR-Cpf1是新開發(fā)的一種基因編輯工具酶,具有很多獨特的優(yōu)勢,包括具有較短的crRNA和低脫靶率等。因此,在人多能干細胞中開發(fā)基于CRISPR-Cpf1的精準基因編輯系統(tǒng)具有十分廣闊的應用前景。而化學小分子具有使用簡便、高效以及非整合等特點,可以用于提高基因編輯效率。在這里,我們在人多能干細胞中構(gòu)建了 CRISPR-Cpf1基因編輯體系,并且開發(fā)了一種無偏好的... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１．１真核細胞中主要的ＤＮＡ斷裂修復方式（引自參考文獻Ｗ）

浙江繼博士雜齡．?１?ｇ［Ｒ??ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ?ｄｏｍａｉｎ??？一?ｘ?（ＺＦ?ｏｒ?ＴＡＬＥ）??Ｆ〇ｋ！＿?ｚｆ?ｕｍｎｎｕｎ＾??…?Ｆｏｋ丨?一?－，）?ＴＡＬＥ??圖１．２?ＺＦＮ和ＴＡＬＥＮ的工作模式圖（引自參考文獻叫９??隨后，研究者們依舊不斷致力于尋找新的基因編輯工具。２０１３年，研究人員??在ＩＩ型細菌的適應性免疫系統(tǒng)ＣＲＩＳＰＲ中開發(fā)出了?Ｃａｓ９核酸酶［１３、１４］，從此，基??因編輯工具得到了廣泛的應用。ＣＲＩＳＰＲ基因編輯系統(tǒng)的開發(fā)和使用是基因編輯??領(lǐng)域中里程碑式的進展，為生物學基礎(chǔ)研究和臨床治療提供了強大的分子工具。??１．１．２?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９基因編輯系統(tǒng)??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９基因編輯系統(tǒng)包含Ｃａｓ９核酸酶以及兩個非編碼的ＣＲＩＳＰＲ單??鏈ＲＮＡ［ｌ３ｌ（圖１．３?）。單鏈ＲＮＡ系統(tǒng)由反式激活ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）和前體ｃｒＲＮＡ??（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）兩部分組成，其中前體ｃｒＲＮＡ包含核酸酶定位序列（ｇＲＮＡ）和??直接重復序列（ＤＲ）。ｇＲＮＡ可以與基因組上前間區(qū)序列臨近基序（ＰＡＭ）前的??特定序列結(jié)合，引導Ｃａｓ９核酸酶定位到基因組上。Ｃａｓ９核酸酶識別ＰＡＭ序列??（ＮＧＧ）之后造成ＤＮＡ的雙鏈斷裂，從而引發(fā)細胞內(nèi)源的ＤＮＡ修復。其中，??通過非同寐末端連接方式進Ｉｆ的ＤＮＡ修復會導致．基因組小片段插入或缺失，進??而產(chǎn)生基因突交或敲除的細胞系，而通過同源重組方式修復基因組可以用來構(gòu)建??基因敲入的細胞系心１６］。??３??

浙江大學博士學雜文?１?ｇ丨Ｒ??Ｃａｓ９??ＤＮＡ??ｌ?ｔｅｍｐｌａｔｅ?ｓｔｒａｎｄ?ＰＡＭ??｜Ｎｏｎ?ｔｅｍｐｌａｔｅｌ??＿！Ｊ?ｓｇＲＮＡ??圖１．３?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９的工作模式圖（引自參考文獻【１？１）。??１．１．３?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ基因編輯系統(tǒng)??２０１５年，張峰實驗室報道了新型基因編輯工具酶ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ（圖１．４）［１８］。??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ可以識別富含胸腺嘧啶（Ｔ）的ＰＡＭ序列，區(qū)別于ＣＲ１ＳＰＲ－Ｃａｓ９??識別的“ＮＧＧ”ＰＡＭ序列，擴大了?ＲＮＡ介導的基因編輯的范圍。此外，不同于??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９造成的ＤＮＡ平末端斷裂，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ造成ＤＮＡ雙鏈斷裂后產(chǎn)??生５?ｎｔ的粘性末端。因此，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ可能會帶來不同的ＤＮＡ修復機制？。??值得一提的是，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ的單鏈ＲＮＡ系統(tǒng)不包含ｔｒａｃｒＲＮＡ，所以長度明顯??短于ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９的單鏈ＲＮＡ長度，因此ｃｒＲＮＡ更適于體外合成和多基因編??輯。而且ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ的脫靶率較低，非常利：于在細胞中進行精準的基因編輯??［２０－２２］??〇??４??

【參考文獻】：
期刊論文
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