發(fā)布時間：2017-04-13 23:06

  本文關(guān)鍵詞：膀胱癌特異性溶瘤腺病毒與順鉑或吉西他濱聯(lián)合抗膀胱腫瘤的體外實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,目前臨床多采用以手術(shù)治療為主,輔以化療、放療和膀胱灌注等方法的綜合治療,但其治愈率遠(yuǎn)未令人滿意。隨著分子生物學(xué)、病毒學(xué)研究的進(jìn)展,腫瘤的病毒基因療法成為近年來非常熱門的一種腫瘤生物治療的方法。有研究報(bào)道將化療和病毒基因治療相結(jié)合殺傷腫瘤細(xì)胞具有很好的療效,為提高腫瘤的治療效果開辟了新的途徑。本課題組成功構(gòu)建了膀胱癌特異性溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A,該腺病毒在膀胱特異性啟動子UPII的控制下能選擇性地在膀胱癌細(xì)胞中復(fù)制進(jìn)而發(fā)揮溶瘤效應(yīng),對正常細(xì)胞沒有影響。順鉑和吉西他濱是臨床治療膀胱癌的常用化療藥物,其作用機(jī)制與溶瘤腺病毒不同。本實(shí)驗(yàn)將Ad/PSCAE/UPII/E1A與化療藥物聯(lián)合,旨在研究兩者聯(lián)用是否能發(fā)揮協(xié)同抗膀胱腫瘤的作用,并初步探討兩者聯(lián)用的可能的機(jī)制,為膀胱癌的治療提供一種新的治療策略,并為將來的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：利用膀胱組織特異性啟動子UPII控制溶瘤腺病毒E1A基因的表達(dá),并在UPII啟動子上游插入前列腺干細(xì)胞抗原增強(qiáng)子(PSCAE)以增強(qiáng)UPII啟動子的活性,構(gòu)建出膀胱癌特異性溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A;以螢火蟲熒光素酶(Luc)報(bào)告基因置換Ad/PSCAE/UPII/E1A中的E1A基因,構(gòu)建出重組腺病毒Ad/PSCAE/UPII/Luc.利用表達(dá)Luc基因的重組腺病毒Ad/PSCAE/UPII/Luc,體外感染膀胱癌細(xì)胞株EJ、5637、BIU87和T24,通過檢測細(xì)胞內(nèi)Luc的活性觀察重組腺病毒對膀胱癌細(xì)胞的感染效率；采用Western blot法分析溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A感染膀胱癌細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)E1A基因的表達(dá)情況；應(yīng)用MTT比色法檢測Ad/PSCAE/UPII/E1A與化療藥(順鉑和吉西他濱)單用或聯(lián)用對人膀胱癌細(xì)胞增殖的影響,并通過聯(lián)合指數(shù)法對聯(lián)合作用進(jìn)行分析；采用MTT比色法檢鋇與化療藥單用或聯(lián)用對人正常尿Ad/PSCAE/UPII/E1A路上皮細(xì)胞SV-HUC-1的細(xì)胞毒作用；利用流式細(xì)胞術(shù)觀察與化療藥單用或聯(lián)用對膀胱癌細(xì)胞周期及凋亡的影響；采用Ad/PSCAE/UPII/E1A法觀察qRT-PCR與化療藥單用或聯(lián)用對凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)因子Ad/PSCAE/UPII/E1A表達(dá)的影響；采用nRNA法分析Western blot與化療藥單用或聯(lián)用Ad/PSCAE/UPII/E1A對凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響；采用Western blot法檢測GEM與Ad/PSCAE/UPII/E1A合用感染T24細(xì)胞后E1A基因在細(xì)胞中的表達(dá)以及GEM對T24細(xì)胞表面CAR表達(dá)的影響。結(jié)果：(1)重組腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A和Ad/PSCAE/UPII/Luc在HEK293細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增后,經(jīng)氯化銫密度梯度離心法純化,獲得了純度較好且滴度較高的腺病毒；(2)Ad/PSCAE/UPII/Luc在體外能有效感染CAR高表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株EJ、5637和BIU87,隨著感染復(fù)數(shù)的增加,細(xì)胞內(nèi)Luc活性相應(yīng)增強(qiáng),呈劑量依賴性；Ad/PSCAE/UPII/Luc感染CAR低表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株T24后,細(xì)胞內(nèi)Luc活性很低,說明感染效率差；(3) Ad/PSCAE/UPII/E1A感染CAR高表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株EJ、5637和BIU87后,三種細(xì)胞株內(nèi)E1A蛋白均呈高表達(dá),說明感染效率高。而Ad/PSCAE/UPII/E1A感染CAR低表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株T24后,細(xì)胞內(nèi)E1A蛋白的表達(dá)很低,說明感染效率差；(4)Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑分別單用均能抑制CAR高表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞的生長,兩者聯(lián)用具有顯著的協(xié)同作用；(5)Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱分別單用均能抑制CAR高表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞的生長,兩者聯(lián)用具有顯著的協(xié)同作用；(6)Ad/PSCAE/UPII/E1A單用不能抑制CAR低表達(dá)的T24細(xì)胞的生長,與順鉑聯(lián)用后無協(xié)同作用,但在與吉西他濱聯(lián)用后產(chǎn)生了顯著的協(xié)同作用；(7)Ad/PSCAE/UPII/E1A能將5637細(xì)胞周期阻滯于G1期,順鉑也能將5637細(xì)胞周期阻滯于G1期,兩者聯(lián)用對G1期的阻滯程度進(jìn)一步加��；(8)Ad/PSCAE/UPII/E1A能將EJ細(xì)胞周期阻滯于G1期,吉西他濱能將EJ細(xì)胞周期阻滯于S期,兩者聯(lián)用對S期的阻滯程度顯著增加；(9)Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑分別單用均能誘導(dǎo)5637細(xì)胞發(fā)生凋亡,兩者聯(lián)用后凋亡更加顯著；(10)Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱分別單用均能誘導(dǎo)EJ細(xì)胞發(fā)生凋亡,兩者聯(lián)用后凋亡更加顯著；(11)Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑聯(lián)用可在轉(zhuǎn)錄水平增加Fas及Bax的表達(dá)、降低Bcl-2的表達(dá)；在蛋白水平上調(diào)Fas、Bax、Bak、活化形式的Bid、caspase 8、9、3及PARP的表達(dá),下調(diào)Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)。說明兩者聯(lián)用可能通過增強(qiáng)外源性及內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)5637細(xì)胞凋亡；(12)Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱聯(lián)用可在轉(zhuǎn)錄水平增加Bax的表達(dá)、降低Bcl-2的表達(dá)；在蛋白水平上調(diào)Bax、Bak、活化形式的caspase 9、3及PARP的表達(dá),下調(diào)Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)。說明兩者聯(lián)用可能通過增強(qiáng)內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)EJ細(xì)胞凋亡；(13)吉西他濱能提高Ad/PSCAE/UPII/Luc和Ad/PSCAE/UPII/E1A對T24細(xì)胞的感染效率；(14)吉西他濱能誘導(dǎo)T24細(xì)胞表面CAR的表達(dá),繼而增強(qiáng)重組腺病毒對細(xì)胞的感染效率；(15) Ad/PSCAE/UPII/E1A聯(lián)合小劑量順鉑或吉西他濱對正常尿路上皮細(xì)胞的殺傷效應(yīng)很小,無明顯相加毒性。結(jié)論：(1)Ad/PSCAE/UPII/E1A 和 Ad/PSCAE/UPII/Luc能在體外有效感染CAR高表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株EJ、5637和BIU87,具有較高的感染效率,而對CAR低表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株T24感染效率差；(2)Ad/PSCAE/UPII/E1A能顯著抑制CAR高表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞的增殖,并呈劑量及時間依賴性,但對CAR低表達(dá)的T24細(xì)胞無抑制作用；(3)Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑聯(lián)用能協(xié)同殺傷CAR高表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞,但對CAR低表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞不產(chǎn)生協(xié)同殺傷作用；(4)Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱聯(lián)用能協(xié)同殺傷CAR高表達(dá)及低表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞；(5) Ad/PSCAE/UPII/E1A能將膀胱癌細(xì)胞周期阻滯于G1期,與順鉑聯(lián)用后G1期阻滯程度加重,而與吉西他濱聯(lián)用后將細(xì)胞周期阻滯于S期；(6)Ad/PSCAE/UPII/E1A能誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡,與順鉑或吉西他濱聯(lián)用后促凋亡作用進(jìn)一步增強(qiáng)；(7) Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑聯(lián)用后可能通過增強(qiáng)外源性及內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡；(8) Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱聯(lián)用后可能通過增強(qiáng)內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡；(9)吉西他濱可能通過誘導(dǎo)T24細(xì)胞表面CAR的表達(dá),增強(qiáng)Ad/PSCAE/UPII/E1A對CAR低表達(dá)的T24細(xì)胞的感染效率,繼而發(fā)揮協(xié)同殺傷T24細(xì)胞的作用；(10)Ad/PSCAE/UPII/E1A具有膀胱癌特異性復(fù)制能力,與小劑量順鉑或吉西他濱聯(lián)用對正常細(xì)胞無相加毒性。
【關(guān)鍵詞】：膀胱癌 溶瘤腺病毒 順鉑 吉西他濱 協(xié)同作用
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.14
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-13
• 前言13-31
• 1.1 膀胱腫瘤及治療現(xiàn)狀13-14
• 1.2 腫瘤基因治療14-20
• 1.3 膀胱癌特異性溶瘤腺病毒膀胱內(nèi)灌注治療及聯(lián)合治療20-21
• 1.4 順鉑吉西他濱在膀胱癌治療中的應(yīng)用21-22
• 1.5 前期工作、立題依據(jù)和本課題主要研究內(nèi)容22-25
• 參考文獻(xiàn)25-31
• 第一部分 膀胱癌特異性溶瘤腺病毒的擴(kuò)增、純化及感染效率的測定31-50
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料31-34
• 1.1.1 主要材料和試劑31-32
• 1.1.2 主要溶液的配制32-33
• 1.1.3 主要儀器及設(shè)備33-34
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法34-44
• 1.2.1 HEK293人胚腎細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存34-36
• 1.2.2 溶瘤腺病毒的擴(kuò)增與純化36-37
• 1.2.3 溶瘤腺病毒滴度的測定37-38
• 1.2.4 膀胱癌細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存38-39
• 1.2.5 重組腺病毒對膀胱癌細(xì)胞感染效率的測定39-44
• 1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法44
• 1.3 結(jié)果44-46
• 1.3.1 擴(kuò)增純化后重組腺病毒滴度測定結(jié)果44
• 1.3.2 重組腺病毒純度測定結(jié)果44-45
• 1.3.3 Ad/PSCAE/UPII/Luc對膀胱癌細(xì)胞感染效率的測定45
• 1.3.4 溶瘤腺病毒感染膀胱癌細(xì)胞后E1A基因在細(xì)胞中的表達(dá)45-46
• 1.4 討論46-48
• 1.5 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-50
• 第二部分 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑或吉西他濱聯(lián)用對膀胱癌細(xì)胞生長的抑制作用50-78
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料50-52
• 2.1.1 主要材料和試劑50
• 2.1.2 主要溶液的配制50-51
• 2.1.3 主要儀器及設(shè)備51-52
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法52-56
• 2.2.1 膀胱癌細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存52
• 2.2.2 MTT比色法檢測細(xì)胞活力52-54
• 2.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡54-55
• 2.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布55-56
• 2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法56
• 2.3 結(jié)果56-73
• 2.3.1 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑單用對人膀胱癌細(xì)胞生長的抑制作用56-58
• 2.3.2 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑聯(lián)用對人膀胱癌細(xì)胞生長的抑制作用58-60
• 2.3.3 Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱單用對人膀胱癌細(xì)胞生長的抑制作用60-62
• 2.3.4 Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱聯(lián)用對人膀胱癌細(xì)胞生長的抑制作用62-64
• 2.3.5 Ad/PSCAE/UPII/E1A、順鉑與吉西他濱分別單用對正常人尿路上皮細(xì)胞SV-HUC-1的影響64-65
• 2.3.6 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑或吉西他濱聯(lián)用對正常人尿路上皮細(xì)胞SV-HUC-1的影響65-67
• 2.3.7 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑聯(lián)用對人膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響67-68
• 2.3.8 Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱聯(lián)用對人膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響68-69
• 2.3.9 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑聯(lián)用對人膀胱癌細(xì)胞周期分布的影響69-71
• 2.3.10 Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱聯(lián)用對人膀胱癌細(xì)胞周期分布的影響71-73
• 2.4 討論73-76
• 2.5 結(jié)論76-77
• 參考文獻(xiàn)77-78
• 第三部分 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑或吉西他濱聯(lián)用發(fā)揮協(xié)同抗膀胱腫瘤作用的機(jī)制78-109
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料78-81
• 3.1.1 主要材料和試劑78-79
• 3.1.2 主要儀器及設(shè)備79-80
• 3.1.3 主要溶液的配制80-81
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法81-90
• 3.2.1 膀胱癌細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存81
• 3.2.2 qRT-PCR法檢測凋亡相關(guān)基因mRNA水平的變化81-84
• 3.2.3 Western blot法檢測凋亡相關(guān)基因蛋白水平的變化84-88
• 3.2.4 吉西他濱對重組腺病毒感染CAR低表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞的效率的影響88-89
• 3.2.5 Western blot法檢測吉西他濱對T24細(xì)胞CAR表達(dá)的影響89-90
• 3.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法90
• 3.3 結(jié)果90-98
• 3.3.1 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑聯(lián)用對凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響90-92
• 3.3.2 Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱聯(lián)用對凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響92-96
• 3.3.3 吉西他濱對重組腺病毒感染CAR低表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞的效率的影響96-97
• 3.3.4 吉西他濱對T24細(xì)胞CAR表達(dá)的影響97-98
• 3.4 討論98-104
• 3.5 結(jié)論104-105
• 參考文獻(xiàn)105-109
• 中英文縮寫索引109-112
• 在學(xué)期間的研究成果112-113
• 致謝113

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 王曉雷,千新來,趙清正,徐震綱,唐平章;E1A基因?qū)︻^頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鱗癌細(xì)胞體外生長的抑制和化放療增敏的作用[J];癌癥;2003年11期

2 姚旭東;葉定偉;朱江;李惠明;唐孝達(dá);;吉西他濱對膀胱癌細(xì)胞系增殖、細(xì)胞周期、凋亡的影響[J];中國癌癥雜志;2006年12期

3 張薇,項(xiàng)永兵,劉振偉,方茹蓉,阮志賢,孫璐,高立峰,金凡,高玉堂;1973-1999年上海市區(qū)老年人惡性腫瘤發(fā)病趨勢分析[J];中華老年醫(yī)學(xué)雜志;2005年09期

4 ;Survivin mRNA expression in urine as a biomarker for patients with transitional cell carcinoma of bladder[J];Chinese Medical Journal;2006年13期

5 千新來,趙清正,王爭,原志慶;E1A基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響[J];中華腫瘤雜志;2000年05期

6 千新來,趙清正,王爭,陳艷,原志慶;E1A基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞化療敏感性的影響[J];中國腫瘤生物治療雜志;2000年02期

  本文關(guān)鍵詞：膀胱癌特異性溶瘤腺病毒與順鉑或吉西他濱聯(lián)合抗膀胱腫瘤的體外實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：304665