目的建立小鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells,EPCs）系作為細(xì)胞模型,采用RNA-seq技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)手段,分析人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）對(duì)小鼠骨髓EPCs增殖影響的差異表達(dá)基因及其主要意義,探討人參皂苷Rg1對(duì)小鼠骨髓EPCs促增殖作用的分子機(jī)制,為利用人參皂苷Rg1治療內(nèi)皮損傷性疾病提供分子生物學(xué)水平依據(jù),同時(shí)尋找促進(jìn)EPCs體外生長(zhǎng)的關(guān)鍵靶點(diǎn),為培養(yǎng)數(shù)量充足、富有活力的EPCs提供新思路。方法1.采用全骨髓差速貼壁培養(yǎng)法與二次酶消化法相結(jié)合,分離和純化小鼠骨髓EPCs。通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞表面抗原表達(dá)率檢測(cè),進(jìn)行所獲EPCs的細(xì)胞鑒定。2.在EPCs的傳代培養(yǎng)過程中,選擇增殖能力強(qiáng)的細(xì)胞,通過有限稀釋培養(yǎng)獲得單克隆細(xì)胞系,并進(jìn)行傳代培養(yǎng)擴(kuò)增。通過形態(tài)學(xué)觀察、生長(zhǎng)特性觀察、細(xì)胞表面抗原檢測(cè)、核型分析、體外成血管實(shí)驗(yàn),進(jìn)行所建細(xì)胞系MBMME2的鑒定。3.取小鼠骨髓EPCs的傳代細(xì)胞和細(xì)胞系MBMME2細(xì)胞,每種細(xì)胞分為7個(gè)組,即4個(gè)人參皂苷Rg1處理組（終濃度分別為5、10、15、20μmol/L）,空白對(duì)照組、溶... 

【文章來源】：湖南師范大學(xué)湖南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：130 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

EPCs的鑒定方法[36]

已有研究表明,人參提取物能競(jìng)爭(zhēng)性與雌二醇、孕激素結(jié)合到后兩者受體位點(diǎn)上。人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1和Rc均具有雌激素樣作用[132]。Chao等在2002年以人乳腺癌細(xì)胞株研究人參皂苷Rg1的雌激素活性及其作用機(jī)制[133]。發(fā)現(xiàn)的濃度在10-15-10-7mol/L范圍內(nèi)的人參皂苷Rg1對(duì)MCF-7的增殖呈劑量依賴關(guān)系,并且最佳濃度為3×10-13mol/L。但是這種增殖能被特異的雌激素受體拮抗劑ICI182780(10-6mol/L)所抑制。因此認(rèn)為人參皂苷Rg1具有雌激素樣活性,此外,人參皂苷Rg1能誘導(dǎo)雌激素調(diào)節(jié)基因p S2的表達(dá)。也有研究顯示:人參皂苷Rg1(1-100μg/mL)對(duì)B16F10和HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)無顯著影響,但可以顯著促進(jìn)CAM一級(jí)血管生成,對(duì)二級(jí)血管有不同程度的促進(jìn)作用,腹腔注射人參皂苷Rg1,荷瘤鼠腫瘤體積抑制率為13.8%,瘤血管生成增殖率為18.1%,表明人參皂苷Rg1對(duì)荷瘤小鼠具有免疫增強(qiáng)活性[134]。Gao等認(rèn)為人參皂苷Rg1在ER陽性細(xì)胞中可能的作用機(jī)制是通過形成含有小窩蛋白Caveolin、連接蛋白Shc、雌激素受體非基因組調(diào)節(jié)因子MNAR(modulator of nongenomic activity of ER)、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體IGFR(insulin-like growth factor-I receptor)和c-Src(cellular nonreceptor tyrosine kinase)的信號(hào)小體,激活ERα募集到質(zhì)膜,并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員增加,然后激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體Gper-EGFR,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)c AMP的增加;在Ser118處引起MEK1/2磷酸化和ERα磷酸化,然后誘導(dǎo)ERE依賴型轉(zhuǎn)錄,最后激活雌激素受體效應(yīng)[135]。人參皂苷Rg1對(duì)ER陽性細(xì)胞可能的作用機(jī)制如圖1-2所示。相關(guān)研究結(jié)果顯示人參皂苷Rg1具有維持CNS刺激功能、抗疲勞、抗高血壓和增強(qiáng)智力的作用[105,128-129]。人參皂苷Rg1通過不同通路作用于不同的靶點(diǎn),起著不同的作用;其可以通過細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用;MAPK信號(hào)通路,Toll樣受體信號(hào)通路、花生四烯酸代謝、細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)[47,101,111,115-116]。通過這些信號(hào)通路與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境、信息處理,信號(hào)分子之間的相互作用,影響細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、脂質(zhì)代謝等。

小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種入25 mL塑料培養(yǎng)瓶,倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞呈圓形,大多懸浮在培養(yǎng)液中,少量沉入瓶壁。培養(yǎng)2 h左右,可見有少量細(xì)胞貼壁,形態(tài)開始發(fā)生改變,由圓形變?yōu)椴灰?guī)則多邊形。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),貼壁細(xì)胞不斷增多。體外培養(yǎng)48 h內(nèi)貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí),大多呈成纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形,少量呈短梭形(圖2-1-A)。這些長(zhǎng)梭形細(xì)胞主要是間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增細(xì)胞,而短梭形細(xì)胞主要為內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增細(xì)胞。開始培養(yǎng)后第二個(gè)48h期間(第49~96 h)貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí),大多呈短梭形、圓形或多邊形,長(zhǎng)梭形細(xì)胞很少(2-1-B)。當(dāng)上述第49~96 h期間貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí),經(jīng)二次酶消化法處理,將第二次酶消化獲取的細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,大多呈鵝卵石形、短梭形、三角形或圓形。在較低密度時(shí),很多細(xì)胞排列成條索樣(圖2-2-A,B)。在較高密度時(shí),細(xì)胞呈鋪路石樣排列(圖2-2-C,D)。由此可見,這些細(xì)胞具有體外培養(yǎng)條件下EPCs擴(kuò)增細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特征。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]人參皂苷Rg1對(duì)糖尿病大鼠肝損傷、氧化應(yīng)激及肝組織Toll樣受體4表達(dá)的影響[J]. 陳羨人,高雅文,鄧小梅.  中國臨床藥理學(xué)雜志. 2020(02)
[2]中藥對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能影響的研究進(jìn)展[J]. 胡珍,徐赟晟,覃小燕,樊官偉,張晗,毛靜遠(yuǎn),高秀梅.  中華中醫(yī)藥學(xué)刊. 2019(04)
[3]人參皂苷Rg1對(duì)骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J]. 蔣文捷,梁雪梅.  中國組織工程研究. 2018(33)
[4]內(nèi)皮細(xì)胞損傷與修復(fù)的研究進(jìn)展[J]. 饒璇,李元建.  中國動(dòng)脈硬化雜志. 2017(05)
[5]人參皂苷Rg1通過PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路調(diào)控異丙腎上腺素致急性心肌缺血大鼠心肌的抗氧化作用[J]. 冷雪,臧安緣,李其芳.  中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志. 2017(11)
[6]不同濃度雌激素對(duì)急性期高血壓腦出血患者的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能及衰老的影響[J]. 楊瑩瑩,陳秋娟,袁文,夏小輝.  山西醫(yī)藥雜志. 2017(03)
[7]人參皂苷Rg1對(duì)體外胚鼠皮層神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和神經(jīng)膠質(zhì)定向分化的影響[J]. 田沫,萬鳳,高健,劉峻崎,李淵淵,張麗娟,司銀楚.  中華中醫(yī)藥雜志. 2016(11)
[8]Roles and mechanisms of ginsenoside in cardiovascular diseases: progress and perspectives[J]. Yingying Sun,Yue Liu,Keji Chen.  Science China（Life Sciences）. 2016(03)
[9]人參皂苷Rg1對(duì)成體干細(xì)胞特性與功能的影響[J]. 何方,余麗梅.  中國藥理學(xué)通報(bào). 2016(03)
[10]人參皂苷Rg1促血管再生作用的研究進(jìn)展[J]. 張慶勇,朱武飛,羅春華.  廣東醫(yī)學(xué). 2015(08)

博士論文
[1]人參皂苷Rg1調(diào)控經(jīng)典Wnt信號(hào)通路延緩造血干/祖細(xì)胞衰老的機(jī)制研究[D]. 李靜.重慶醫(yī)科大學(xué) 2017
[2]人參皂苷Rg1調(diào)控FoxO3a相關(guān)信號(hào)通路抑制人臍血源基質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的研究[D]. 劉穎.重慶醫(yī)科大學(xué) 2017
[3]人參皂苷Rg1改善氧化應(yīng)激引起的糖皮質(zhì)激素抵抗的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 李俊.第二軍醫(yī)大學(xué) 2016
[4]人參及其皂苷對(duì)黑色素瘤與血管生成的影響[D]. 鄭斯文.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2016
[5]人參皂苷Rg1和Re通過TLR4通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抗內(nèi)毒素作用[D]. 蘇菲.浙江大學(xué) 2015
[6]人參皂苷Rg1延長(zhǎng)C57BL/6J小鼠壽命及延緩腦老化的機(jī)制研究[D]. 楊璐萌.福建醫(yī)科大學(xué) 2013
[7]人參皂苷Rg1促進(jìn)糖尿病小鼠缺血肢體血管新生的研究[D]. 楊乃全.南京醫(yī)科大學(xué) 2013
[8]雌激素膜受體所介導(dǎo)的PI（3）K傳導(dǎo)通路激活在內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和遷移中的作用[D]. 張文奪.復(fù)旦大學(xué) 2005

碩士論文
[1]西格列汀對(duì)高糖刺激下大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移功能影響及機(jī)制研究[D]. 徐丹丹.鄭州大學(xué) 2014
[2]人參皂苷Rg1對(duì)人臍血CD34+造血干細(xì)胞增殖分化及鈣敏感受體的影響[D]. 潘麗.遵義醫(yī)學(xué)院 2011
[3]丹參多酚酸鹽對(duì)體外培養(yǎng)的人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、粘附及NO分泌功能影響的研究[D]. 嚴(yán)鳳娣.揚(yáng)州大學(xué) 2008
[4]辛伐他汀對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移、凋亡及黏附影響的研究[D]. 楊乃全.南京醫(yī)科大學(xué) 2008
[5]吡格列酮對(duì)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量與增殖能力的影響[D]. 周文靜.浙江大學(xué) 2008



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