本文關(guān)鍵詞：青蒿琥酯對(duì)破骨細(xì)胞的作用和分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景破骨細(xì)胞(osteoclasts, OCs)介導(dǎo)的骨吸收與成骨細(xì)胞(osteoblasts, OBs)介導(dǎo)的骨生成達(dá)到平衡維持骨代謝穩(wěn)態(tài)。然而,當(dāng)失去平衡則可能發(fā)生骨骼疾病。破骨細(xì)胞是體內(nèi)唯一具備骨吸收功能的細(xì)胞,過(guò)度激活將引起骨質(zhì)過(guò)度吸收,造成骨破壞,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松(osteoporosis, OP)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)等常見關(guān)節(jié)疾病。目前用于治療這些疾病的藥物主要有糖皮質(zhì)激素類或非甾體類抗炎藥、抗生素和免疫抑制劑等。然而,它們不能改善骨破壞,或會(huì)引起子宮癌、卵巢癌和乳腺癌等不良反應(yīng)和增加心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn),一些傳統(tǒng)抗炎藥物如地塞米松、甲氨喋呤(Methotrexate, MTX)等反而能促進(jìn)破骨細(xì)胞形成或促進(jìn)骨破壞。靶向抑制破骨細(xì)胞的制劑,成為一類能夠治療破骨細(xì)胞過(guò)度激活引發(fā)骨破壞、并減輕相關(guān)疾病痛苦的藥物。破骨細(xì)胞由造血巨噬細(xì)胞／單核細(xì)胞譜系前體細(xì)胞分化,其經(jīng)歷了前體細(xì)胞的增殖、分化融合和激活過(guò)程。RANKL和M-CSF (macrophage-colony stimμlating factor,巨噬細(xì)胞集落刺激因子)是破骨細(xì)胞生成的必需因子。在破骨細(xì)胞的生成過(guò)程中,RANKL與受體RANK(激活核因子NF-κB受體,receptor activation of nuclear factor NF-κB)結(jié)合,募集并激活銜接分子TRAF6,激活蛋白激酶MAPK(ERK、JNK和p38)和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1和NFAT,這些轉(zhuǎn)錄因子的活化上調(diào)破骨細(xì)胞相關(guān)基因,從而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是G-菌細(xì)胞壁的主要成分,是眾所周知的導(dǎo)致炎癥性骨丟失的病原體,并且是第一個(gè)在體外有能力誘導(dǎo)骨吸收的細(xì)菌成分。LPS引起的骨丟失與其誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化與活化有關(guān),其機(jī)制包括：LPS通過(guò)增強(qiáng)RANK信號(hào)和COX-2表達(dá)促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和活化；LPS可通過(guò)刺激TNF-α在內(nèi)的細(xì)胞因子產(chǎn)生后誘導(dǎo)具有骨吸收活性的破骨細(xì)胞的分化與活化；或直接促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、融合、生存和活化。青蒿琥酯(artesunate, Art)為中藥青蒿有效成分青蒿素的半合成衍生物,是臨床治療惡性瘧最有效、低毒的藥物之一,近年表現(xiàn)出越來(lái)越多的抗炎免疫抑制作用。青蒿琥酯可抑制NF-κB、IκB、TNF-α,IL-6和Th反應(yīng)等改善結(jié)腸炎,膿毒血癥；抑制II型膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎或佐劑性關(guān)節(jié)炎,抑制膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松。上述疾病中,有很多疾病屬于“骨免疫學(xué)”范疇下破骨細(xì)胞過(guò)度活化、骨質(zhì)破壞明顯升高的疾病。但是,該藥能否影響破骨細(xì)胞生成未有研究報(bào)道,能否通過(guò)抑制破骨細(xì)胞改善“骨免疫學(xué)”范疇下破骨細(xì)胞相關(guān)骨破壞疾病未見報(bào)道。本文將建立RANKL和LPS誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系和體內(nèi)去卵巢骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型和LPS誘導(dǎo)的急性骨破壞動(dòng)物模型,探討青蒿琥酯對(duì)破骨細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制。本研究主要包括三部分內(nèi)容：1.青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞及小鼠去卵巢骨質(zhì)疏松的影響；2.青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞作用機(jī)制；3.青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞及小鼠急性骨破壞的影響和作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法1.通過(guò)MTT法考察3.125、6.25和12.5 μM青蒿琥酯于8 h、24 h、48 h、7 d對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性,以確定其體外實(shí)驗(yàn)濃度。利用RAW264.7細(xì)胞和骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(BMMs)兩種細(xì)胞建立體外RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系,通過(guò)TRAP染色法考察3.125、6.25和12.5 μM青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞和BMMs轉(zhuǎn)化成破骨細(xì)胞的影響并以Real-time PCR檢測(cè)破骨細(xì)胞相關(guān)基因c-Src、Fra-2、RAP、β3-Integrin、Cathepsin K、MMP-9、DC-STAMP和Atp6v0d2等mRNA表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證,以驗(yàn)證青蒿琥酯對(duì)破骨細(xì)胞生成和骨吸收功能的影響。利用Osteo Assay Surface 96-well Plate板通過(guò)骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)3.125、6.25和12.5μL濃度的青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞破骨活性的影響。建立去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠骨破壞模型,以唑來(lái)膦酸作為陽(yáng)性對(duì)照藥,通過(guò)考察青蒿琥酯對(duì)模型小鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Sp等骨參數(shù)及小鼠血清RANKL、OPG、TRAP-5b和ALP等相關(guān)細(xì)胞因子等指標(biāo)的影響,體內(nèi)評(píng)價(jià)青蒿琥酯對(duì)破骨細(xì)胞相關(guān)的小鼠骨破壞的影響。2.青蒿琥酯抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成的作用機(jī)制。首先采用Real-time PCR、Western blot和熒光素酶報(bào)道基因技術(shù),分別檢測(cè)NFATc1轉(zhuǎn)錄基因的mRNA、NFATc1蛋白和熒光素酶報(bào)道基因表達(dá)水平變化,從三個(gè)不同側(cè)面考察青蒿琥酯對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子NFATc1活化的影響。Western blot檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)的NFATc1信號(hào)通路上游蛋白鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)的影響。通過(guò)以Fluo-3/AM作為Ca2+探針的confocal技術(shù)考察青蒿琥酯對(duì)200s內(nèi)RANKL誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響。利用Western blot技術(shù)檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)的PLCγ1磷酸化的影響。通過(guò)Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)RANKL/RANK信號(hào)通路上游信號(hào)分子RANK、TRAF6表達(dá)的影響。最后通過(guò)熒光素酶報(bào)道基因技術(shù)檢測(cè)RANKL刺激RAW264.7細(xì)胞NF-κB報(bào)告基因表達(dá)變化,以考察青蒿琥酯對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。3.建立體外LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系,通過(guò)TRAP染色法考察青蒿琥酯在3.125、6.25和12.5μL濃度下對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)化成破骨細(xì)胞的影響；采用Real-time PCR技術(shù),檢測(cè)3.125μM和12.5μL濃度的青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中破骨細(xì)胞相關(guān)因子Fra-2、TRAP、β3-Integrin、Cathepsin K、DC-STAMP和Atp6v0d2等mRNA表達(dá)水平的影響,以進(jìn)一步證實(shí)青蒿琥酯對(duì)破骨細(xì)胞生成的影響。通過(guò)ELISA技術(shù)檢測(cè)不同濃度的青蒿琥酯(3.125、6.25和12.5μM)對(duì)體外LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-a的影響。建立LPS誘導(dǎo)的小鼠急性骨破壞模型：分別于第0d和第4d腹腔注射LPS 5 mg/kg建立模型,腹腔注射青蒿琥酯10mg/kg/d進(jìn)行藥物干預(yù),共8 d。通過(guò)考察對(duì)模型動(dòng)物骨參數(shù)(骨礦物質(zhì)密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量和骨小梁分離度)及血清中TNF-a等指標(biāo)的影響,評(píng)價(jià)青蒿琥酯對(duì)炎癥性骨破壞的影響。青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的作用機(jī)制研究。在體外LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞體系中,首先采用Real-time PCR、Western blot和熒光素酶報(bào)道基因技術(shù),分別檢測(cè)NFATc1轉(zhuǎn)錄基因的mRNA、NFATc1蛋白和熒光素酶報(bào)道基因表達(dá)水平變化,考察青蒿琥酯對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子NFATc1活化的影響。Western blot檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的NFATc1信號(hào)通路上游蛋白鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)的影響。通過(guò)以Fluo-3/AM作為Ca2+探針的confocal技術(shù)考察青蒿琥酯對(duì)200s內(nèi)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響。利用Western blot技術(shù)檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的PLCyl磷酸化的影響。通過(guò)Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成信號(hào)通路上游信號(hào)分子TLR4、TRAF6表達(dá)的影響。最后通過(guò)熒光素酶報(bào)道基因技術(shù)檢測(cè)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞NF-κB報(bào)告基因表達(dá)變化,以判斷考察青蒿琥酯對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)除12.5μM青蒿琥酯干預(yù)24h、48 h、7d(生存率分別為分別為94.55%,P0.05；85.61%,P0.05和91.60%,P0.05)外,0-12.5μM青蒿琥酯7d內(nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)明顯影響。通過(guò)TRAP染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3.125 μM (P0.01)、6.25 μM (P0.001)和12.5μM(P0.001)青蒿琥酯能夠顯著抑制體外RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞,并且呈劑量依賴性(F=124.566,P0.001)；與對(duì)RAW264.7結(jié)果一致,青蒿琥酯劑量依賴性地抑制RANKL誘導(dǎo)BMMs分化成破骨細(xì)胞(F=79.919,P0.001)。通過(guò)骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3.125、6.25和12.5 1μM青蒿琥酯能濃度依賴性地顯著減少骨陷窩面積(F=50.855,P=0.003)。通過(guò)Real-time PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能夠濃度依賴性地顯著抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞相關(guān)基因c-Src (F=245.807, P0.001)、 Fra-2 (F=102.631, P0.001)、β3-Integrin (F=21.97, P0.001)、Cathepsin K (F=510.220, P0.001)和MMP-9 (F=88.322, P0.001)等mRNA表達(dá)水平上升,12.5μM濃度還對(duì)TRAP (F=403.031, P0.001)、DC-STAMP (F=23.369, P=0.001)和Atp6v0d2 (F=427.932, P0.001)的mRNA表達(dá)水平。通過(guò)Micro-CT掃描分析小鼠股骨的影像學(xué)特征,發(fā)現(xiàn)30 mg/kg青蒿琥酯和陽(yáng)性對(duì)照藥唑來(lái)膦酸能明顯改善骨質(zhì)疏松小鼠的骨組織形態(tài),ROI(感興趣區(qū),region of interest)區(qū)域明顯填充,體積增大,骨小梁數(shù)目明顯增多且連接緊密,提示青蒿琥酯能逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松所致骨量減少和保護(hù)骨基質(zhì)；通過(guò)分析小鼠股骨骨參數(shù)發(fā)現(xiàn),青蒿琥酯與陽(yáng)性對(duì)照藥唑來(lái)膦酸作用一致,能顯著升高骨質(zhì)疏松小鼠骨礦物質(zhì)密度(F=62.597,P0.001)、骨體積分?jǐn)?shù)(F=32.563,P0.001)、骨小梁數(shù)量(F=18.005,P0.001),降低骨小梁分離度(F=25.557,P0.001);顯著降低OVX小鼠血清中RANKL含量(F=11.208, P0.001), RANKL/OPG比值(F=22.399,P0.001)和TRAP-5b酶活力(F=6.937,P0.001),升高OPG含量(F=24.557,P0.001)和ALP酶活性(F=3.201,P0.01)。2.對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),青蒿琥酯3.125(P0.001)和12.5 μM(P0.001)濃度均能濃度依賴性地顯著抑制RANKL誘導(dǎo)的NFATc1基因水平上調(diào)(F=123.524,P0.001)；青蒿琥酯3.125-12.5 μM濃度下能濃度依賴性地顯著增加胞漿無(wú)活性形式的NFATc1即p-NFATc1蛋白的表達(dá)量,同時(shí)也能濃度依賴性地顯著抑制細(xì)胞核內(nèi)NFATc1蛋白的表達(dá),即青蒿琥酯能顯著抑制RANKL誘導(dǎo)的NFATc1核轉(zhuǎn)位；青蒿琥酯(3.125、6.25和12.5μM)與陽(yáng)性對(duì)照藥CsA (1 μM)均能顯著降低RANKL誘導(dǎo)的NFAT熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)上升(F=26.590,P0.001)。上述三個(gè)不同層面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,青蒿琥酯能抑制核轉(zhuǎn)錄因子NFATc1的活化。青蒿琥酯在3.125-12.5μM濃度下顯著抑制RANKL對(duì)NFATcl信號(hào)通路上游分子PP2B-Aa蛋白的上調(diào)。3.125和12.5μM青蒿琥酯濃度依賴性地顯著降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(F=19.570,P0.001),特別是12.5μM青蒿琥酯與陽(yáng)性對(duì)照藥CsA降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的作用接近于空白對(duì)照組。3.125-12.5μM青蒿琥酯濃度依賴性地抑制RANKL誘導(dǎo)的Ca2+信號(hào)通路上游分子p-PLCγ1蛋白水平的上調(diào)。青蒿琥酯濃度依賴性抑制RANKL/RANK信號(hào)通路上游信號(hào)分子TRAF6基因(F=41.395,P0.001)和蛋白表達(dá)；12.5μM青蒿琥酯能顯著抑制上游信號(hào)分子RANK基因表達(dá)(F=30.819,P0.001)。陽(yáng)性對(duì)照藥NF-κB抑制劑BAY11-7082在5 μM濃度下能顯著抑制RANKL誘導(dǎo)的NF-κB報(bào)告基因表達(dá)上升,抑制率約50%(P0.05)。但是,但是,僅50μM濃度(P0.05)的青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)的NF-κB報(bào)告基因表達(dá)上升呈現(xiàn)抑制效應(yīng),3.125-25μM濃度下未見抑制效應(yīng)。提示青蒿琥酯可能不是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)影響OCs的生成與骨吸收功能。3.通過(guò)TRAP染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3.125、6.25和12.5μM青蒿琥酯能夠顯著抑制體外LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞,并且呈濃度依賴性(F=67.221,P0.001)。3.125、6.25和12.5 μM青蒿琥酯能濃度依賴性地顯著抑制OCs培養(yǎng)液中LPS誘導(dǎo)的TNF-α上調(diào)(F=1 17.712,P0.001)。3.125μL和12.5μL青蒿琥酯顯著抑制LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞前體RAW264.7細(xì)胞的Fra-2 (F=17.440, P0.001)、TRAP (F=40.550, P0.001)、Cathepsin K (F=26.400, P0.000)、 DC-STAMP (F=12.870, P=0.002)和Atp6v0d2 (F=161.500,P0.001)等mRNA表達(dá)水平上升,12.5μL濃度還對(duì)β3-Integrin的mRNA表達(dá)水平具有顯著抑制效應(yīng)(F=30.900,P0.001)。通過(guò)Micro-CT掃描分析小鼠股骨的影像學(xué)特征,發(fā)現(xiàn)10mg/kg青蒿琥酯能顯著恢復(fù)LPS誘導(dǎo)的急性骨破壞模型小鼠骨量降低；通過(guò)分析小鼠股骨骨參數(shù)發(fā)現(xiàn),10mg/kg青蒿琥酯能顯著升高小鼠骨礦物質(zhì)密度(F-7.217,P=0.014)、骨體積分?jǐn)?shù)(F=6.621,P=0.017)、骨小梁數(shù)量(F=6.561,P=0.018),降低骨小梁分離度(F=5.778,P=0.024)；10 mg/kg青蒿琥酯能顯著降低LPS誘導(dǎo)的小鼠血清中TNF-a含量(F=10.85,P=0.004)。對(duì)LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),青蒿琥酯3.125和12.5μM濃度均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NFATcl基因水平上調(diào),并且抑制效應(yīng)呈濃度依賴性(F=90.330,P0.001)；青蒿琥酯3.125-12.5μM濃度下能顯著提高胞漿p-NFATc1蛋白的表達(dá)量,同時(shí)也能濃度依賴性地顯著抑制細(xì)胞核內(nèi)NFATc1蛋白的表達(dá),即青蒿琥酯能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NFATc1核轉(zhuǎn)位；12.5μM青蒿琥酯與1μM陽(yáng)性對(duì)照藥CsA均能顯著降低LPS誘導(dǎo)的NFAT熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)上升(F=26.321,P0.001)。上述三個(gè)不同層面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,青蒿琥酯能抑制LPS誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子NFATc1的活化。青蒿琥酯在3.125-12.5μM濃度下顯著抑制LPS對(duì)NFATc1信號(hào)通路上游分子PP2B-Aa蛋白的上調(diào)。3.125(P0.001)和12.5μM(P0.001)青蒿琥酯濃度依賴性地顯著降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(F=38.618, P0.001)。3.125-12.5μM青蒿琥酯濃度依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的Ca2+信號(hào)通路上游分子p-PLCyl蛋白水平的上調(diào)。青蒿琥酯劑量依賴性抑制上游信號(hào)分子TRAF6蛋白表達(dá);12.5 μM青蒿琥酯能顯著抑制上游信號(hào)分子TRAF6基因(F=24.862,P0.001)和TLR4基因表達(dá)(F=9.558,P=0.014)。陽(yáng)性對(duì)照藥NF-κB抑制劑BAY1 1-7082在5μM濃度下能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB報(bào)告基因表達(dá)上升(P0.001),抑制率約50%。但是,僅25(P0.05)、50μM(P0.01)濃度的青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的NF-κB報(bào)告基因表達(dá)上升呈現(xiàn)抑制效應(yīng)(F=25.501,P0.001),3.125-12.5 μM濃度下未見抑制效應(yīng)(P0.05),提示青蒿琥酯可能不是主要通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)影響OCs的生成與骨吸收功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)論1.青蒿琥酯能夠顯著抑制體外RANKL和LPS誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞分化形成破骨細(xì)胞,抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能。2.青蒿琥酯具有改善去卵巢骨質(zhì)疏松模型和LPS誘導(dǎo)的急性骨破壞模型小鼠破骨細(xì)胞過(guò)度活化所致的骨破壞、提高骨質(zhì)密度的作用,可望用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松等骨破壞性疾病。3.青蒿琥酯發(fā)揮作用的靶點(diǎn)可能主要是銜接分子TRAF6和核轉(zhuǎn)錄因子NFATc1,可能主要通過(guò)抑制TRAF6-Ca2+-calcineurin-NFATc 1信號(hào)通路從而抑制破骨細(xì)胞的生成和骨破壞功能。
【關(guān)鍵詞】：青蒿琥酯 破骨細(xì)胞 Ca~(2+) NFATc1 脂多糖 骨破壞
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R965
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-25
• 前言25-29
• 第1章 青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞及去卵巢骨質(zhì)疏松的影響29-52
• 1.1 材料29-30
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物29
• 1.1.2 試劑29-30
• 1.1.3 儀器與設(shè)備30
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法30-36
• 1.2.1 考察青蒿琥酯對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用30-31
• 1.2.2 青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨前體細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞的影響31
• 1.2.3 青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞破骨活性的影響31-32
• 1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響32-34
• 1.2.5 青蒿琥酯對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型小鼠骨破壞的影響34-35
• 1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法35-36
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-52
• 1.3.1 青蒿琥酯對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞生存作用36-37
• 1.3.2 青蒿琥酯抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨前體細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞37-42
• 1.3.3 青蒿琥酯抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞破骨活性42-44
• 1.3.4 青蒿琥酯抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)44-46
• 1.3.5 青蒿琥酯抑制去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠骨破壞46-52
• 第2章 青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞作用機(jī)制52-72
• 2.1 材料52-53
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株52
• 2.1.2 試劑52
• 2.1.3 儀器與設(shè)備52-53
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法53-60
• 2.2.1 青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子NFATc1活化的影響53-56
• 2.2.2 Western blot檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)的NFATc1信號(hào)通路上游蛋白鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)的影響56-57
• 2.2.3 Confocal檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度的影響57
• 2.2.4 Western blot檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)RANKL誘導(dǎo)的Ca~(2+)信號(hào)通路上游分子PLCγ1磷酸化的影響57-58
• 2.2.5 青蒿琥酯對(duì)RANKL/RANK信號(hào)通路上游信號(hào)分子RANK、TRAF6表達(dá)的影響58-59
• 2.2.6 青蒿琥酯對(duì)RANKL刺激RAW264.7細(xì)胞NF-κB報(bào)告基因表達(dá)的影響59-60
• 2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法60
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-72
• 2.3.1 青蒿琥酯抑制RANKL誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子NFATc1的活化60-64
• 2.3.2 蒿琥酯抑制RANKL誘導(dǎo)的NFATc1信號(hào)通路上游蛋白鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)64
• 2.3.3 青蒿琥酯降低細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度64-67
• 2.3.4 青蒿琥酯抑制RANKL誘導(dǎo)的Ca~(2+)信號(hào)通路上游分子PLCγ1磷酸化67
• 2.3.5 青蒿琥酯對(duì)RANKL/RANK信號(hào)通路上游信號(hào)分子RANK、TRAF6表達(dá)的影響67-69
• 2.3.6 青蒿琥酯對(duì)RANKL刺激RAW264.7細(xì)胞NF-κB報(bào)告基因表達(dá)69-72
• 第3章 青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞及急性骨破壞的影響和作用機(jī)制72-106
• 3.1 材料72-74
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物72
• 3.1.2 試劑72-73
• 3.1.3 儀器與設(shè)備73-74
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法74-84
• 3.2.1 青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成的影響74
• 3.2.2 青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的TNF-α生成的影響74
• 3.2.3 Real-time PCR檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響74-76
• 3.2.4 青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性骨破壞小鼠模型的影響76-78
• 3.2.5 青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子N-FATc1活化的影響78-80
• 3.2.6 Western blot檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的NFATc1信號(hào)通路上游蛋白鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)的影響80-81
• 3.2.7 Confocal檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度的影響81
• 3.2.8 Western blot檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的Ca~(2+)信號(hào)通路上游分子PLCγ1磷酸化的影響81-82
• 3.2.9 青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞上游信號(hào)分子TLR4、TRAF6表達(dá)的影響82-83
• 3.2.10 青蒿琥酯對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞NF-κB報(bào)告基因表達(dá)的影響83-84
• 3.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法84
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果84-106
• 3.3.1 青蒿琥酯抑制LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成84-86
• 3.3.2 青蒿琥酯抑制LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的TNF-α生成86-88
• 3.3.3 青蒿琥酯抑制LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)88-90
• 3.3.4 青蒿琥酯抑制LPS誘導(dǎo)的急性骨破壞90-93
• 3.3.5 青蒿琥酯抑制LPS誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子NFATc1活化93-97
• 3.3.6 青蒿琥酯抑制LPS誘導(dǎo)的NFATc1信號(hào)通路上游蛋白鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)97-98
• 3.3.7 青蒿琥酯降低細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度98-101
• 3.3.8 青蒿琥酯抑制LPS誘導(dǎo)的Ca~(2+)信號(hào)通路上游分子PLCγ1磷酸化101
• 3.3.9 青蒿琥酯抑制LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞上游信號(hào)分子TLR4、TRAF6表達(dá)101-104
• 3.3.10 青蒿琥酯對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞NF-κB報(bào)告基因表達(dá)104-106
• 討論106-114
• 全文結(jié)論114-115
• 參考文獻(xiàn)115-127
• 縮寫詞中英文對(duì)照表127-130
• 成果130-132
• 致謝132-134
• 論文統(tǒng)計(jì)學(xué)合格證明134

  本文關(guān)鍵詞：青蒿琥酯對(duì)破骨細(xì)胞的作用和分子機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：294243