研究背景動脈粥樣硬化性心血管疾病(Atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)是慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)患者死亡的重要原因。高磷血癥(Hyperphosphatemia)是CKD患者,尤其終末期腎臟病(End stage renal disease,ESRD)患者常見的并發(fā)癥。流行病學(xué)與臨床研究表明:血磷水平增高與膽固醇代謝異常及動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)風(fēng)險密切相關(guān),但具體分子機制尚未闡明。目的本課題在前期動物實驗研究基礎(chǔ)上,旨在深入揭示高磷血癥對血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)的影響,進一步探索高磷血癥通過改變膽固醇敏感器-固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白(Sterol regulatory element binding protein cleavage activating protein,SCAP)的糖基化修飾,加速VSMCs內(nèi)膽固醇異常合成與蓄積,導(dǎo)致AS斑塊泡沫細胞形成的分子機制。方法1.選擇原代人主動脈VSMCs為細胞模型,予以不同濃度磷(Pi1.0~3.0mmol/L)、鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運體(Sodium-dependent phosphate cotransporter,NPC)阻斷劑磷甲酸(Phosphonoformic acid,PFA)以及SCAP和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(Sterol regulatory element binding protein,SREBP2)的小干擾RNA(Small interference RNA,siRNA)干預(yù)細胞。通過中性脂質(zhì)油紅O染色、酶法定量膽固醇測定、Real-time PCR、Western blotting及激光共聚焦等方法,檢測高磷環(huán)境(Pi3.0mmol/L)對VSMC內(nèi)膽固醇水平與細胞內(nèi)膽固醇代謝關(guān)鍵分子,如羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl coenzyme A reductase,HMRCR)、低密度脂蛋白受體(Low density lipoprotein receptor,LDLr)、SREBP2、SCAP等mRNA和蛋白水平、功能的影響。2.通過蛋白質(zhì)半衰期檢測、N-糖基化誘導(dǎo)與抑制試驗、N-糖鏈類型酶切鑒定以及激光共聚焦等手段,探討高磷血癥致SCAP異常轉(zhuǎn)位激活SREBP2的關(guān)鍵分子機制。3.通過酶促化學(xué)反應(yīng)比色法、Real-time PCR及Western blotting等方法,檢測復(fù)雜型N-糖基化的關(guān)鍵酶—α-甘露糖苷酶Ⅱ(α-MannosidaseⅡ,α-MANⅡ)在SCAP介導(dǎo)的細胞內(nèi)膽固醇合成中的功能,并利用siRNA基因沉默技術(shù),進一步揭示α-MAN2A1與α-MAN2A2在增強SCAP N-糖鏈由高甘露糖型向復(fù)雜型轉(zhuǎn)化中的作用。結(jié)果1.高磷環(huán)境下,VSMCs內(nèi)中性脂質(zhì)大量聚集,總膽固醇(Total Cholesterol,TC)及膽固醇酯(Cholesterol Ester,CE)水平明顯增高。高磷環(huán)境不影響肝X受體α(Liver X receptor,LXRα)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(Adenosine triphosphate binding cassette transporter 1,ABCA1)的mRNA與蛋白水平,但顯著上調(diào)SREBP2、HMGCR與LDLr的基因轉(zhuǎn)錄,增高SREBP2的活性氨基末端片段(The NH_2 terminal fragment of SREBP2,SREBP2-N)、HMGCR及SCAP的蛋白水平。高磷環(huán)境下,SCAP熒光染色明顯增強,且與高爾基體共定位明顯增加。磷呈劑量依賴性(Pi 1.0~5.0mmol/L)地上調(diào)HMGCR、SCAP蛋白水平。3.0mmol/L磷處理VSMC后4小時即檢測到SCAP蛋白明顯增高,16小時即檢測到HMGCR水平明顯增高。磷通道阻滯劑PFA可明顯阻斷高磷環(huán)境下上述分子的基因及蛋白表達變化,并抵消其對VSMCs內(nèi)膽固醇的蓄積作用。沉默SCAP或沉默SREBP2基因表達能夠顯著降低VSMCs內(nèi)HMGCR表達及SREBP2-N蛋白水平,同時抵消高磷環(huán)境對VSMCs內(nèi)膽固醇的蓄積作用。2.生理條件下(磷1.0mmol/L),放線菌酮(Cycloheximide,CHX)處理8小時,SCAP蛋白水平顯著下降;CHX處理后24h,SCAP蛋白水平即衰減至0h時的22%。但高磷環(huán)境下,SCAP蛋白質(zhì)水平在CHX處理后24小時才出現(xiàn)顯著下降,且維持在0h時的48.9%。N-糖基化促進劑—N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)(20mmol/L)顯著提高SREBP2及HMGCR表達水平,而N-糖基化抑制劑—衣霉素(Tunicamycin,Tuni)(1μg/mL)可抵消高磷環(huán)境對上述分子表達的上調(diào)作用。生理條件下,SCAP蛋白N-糖鏈大部分呈對Endo.H敏感的高甘露糖型,而高磷環(huán)境下則絕大部分成為對Endo.H抵抗的復(fù)雜型糖鏈。SCAP N-糖鏈向復(fù)雜型轉(zhuǎn)化后,SCAP蛋白降解顯著延遲,促進活化SREBP2及其下游分子表達。GlcNAc增強VSMCs內(nèi)SCAP熒光強度及其與高爾基體共定位,該作用與高磷環(huán)境相似。Tuni減弱VSMCs內(nèi)SCAP熒光強度及其與高爾基體共定位,并抵消高磷環(huán)境對SCAP熒光強度及與高爾基體共定位的影響。3.高磷環(huán)境下,VSMCs內(nèi)α-MANⅡ活性明顯增強,該變化可被Tuni或PFA明顯抵消。隨著磷濃度增加,α-MANⅡ活性逐漸增強。沉默α-MAN2A1或α-MAN2A2基因,可阻斷高磷環(huán)境對VSMCs內(nèi)α-MANⅡ活性的增強作用,恢復(fù)SCAP蛋白降解速率,減弱SCAP蛋白與高爾基體的共定位,并減少SREBP2及HMGCR的mRNA表達。結(jié)論1.高磷環(huán)境下,人原代主動脈VSMCs內(nèi)膽固醇顯著蓄積,該蓄積效應(yīng)由SCAP-SREBP2信號通路特異性介導(dǎo)。在轉(zhuǎn)錄后水平,SCAP蛋白質(zhì)含量顯著增高,增強其由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)位激活SREBP2的功能,增多的SREBP-N轉(zhuǎn)位入核,上調(diào)HMGCR基因轉(zhuǎn)錄,增強細胞內(nèi)的膽固醇合成,最終導(dǎo)致其異常蓄積。2.促進或抑制N-糖基化過程可調(diào)控HMGCR及SREBP2的表達。高磷環(huán)境下,SCAP蛋白質(zhì)N-糖鏈由高甘露糖型向復(fù)雜型轉(zhuǎn)化顯著增加,致VSMCs內(nèi)SCAP蛋白降解減慢,半衰期延長。3.高磷血癥通過增加VSMCs內(nèi)α-MANⅡ的活性,促進SCAP蛋白質(zhì)N-糖鏈復(fù)雜型轉(zhuǎn)化。阻斷VSMCs外環(huán)境中的磷向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運,或抑制N-糖鏈由高甘露糖型向復(fù)雜型轉(zhuǎn)化過程能夠恢復(fù)VSMCs內(nèi)SCAP正常降解,維持SCAP對SREBP2轉(zhuǎn)位激活及細胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)功能。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R692.5;R589.5
【部分圖文】：

將傳代至5-7代的VSMCs分為兩組:正常磷組(Ctrl組)及高磷組(Pi組)。先予以2%FBS的實驗培養(yǎng)基預(yù)處理24h,再分別予以正常磷環(huán)境(Pi 1.0mmol/L的實驗培養(yǎng)基)或高磷環(huán)境(Pi 3.0mmol/L的實驗培養(yǎng)基)處理24h,進行油紅O染色。結(jié)果顯示:Pi組VSMCs細胞內(nèi)紅色中性脂滴明顯增多,提示高磷環(huán)境促進VSMCs細胞內(nèi)中性脂質(zhì)蓄積。3.2高磷環(huán)境對VSMCs內(nèi)膽固醇含量的影響

細胞內(nèi)膽固醇含量測定結(jié)果表明:高磷組(含Pi 3.0 mmol/L的實驗培養(yǎng)基)VSMCs內(nèi)TC含量達103.25±11.20μg/mg,而對照組(含Pi 1.0 mmol/L的實驗培養(yǎng)基)為62.60±8.45μg/mg(P<0.01)。高磷組VSMCs內(nèi)CE含量達74.12±8.51μg/mg,而對照組為36.05±40μg/mg(P<0.01)。兩組間FC含量無顯著變化,分別29.13±6.89μg/mg和26.56±5.68μg/mg。3.3高磷環(huán)境對VSMCs膽固醇代謝相關(guān)分子mR NA表達水平的影響

VSMCs分為對照組(Pi 1.0mmol/L)及高磷組(Pi 3.0mmol/L),采用Real-time PCR法檢測高磷對VSMCs膽固醇代謝相關(guān)分子HMGCR、LDLr、SREBP2、ABCA1及LXRαmRNA表達水平的影響。圖1.3所示,與對照組相比,高磷組VSMCs HMGCR mRNA表達增至1.97±0.13倍(P<0.01),LDLr mRNA表達增至1.35±0.24倍(P<0.05),SREBP2mRNA表達增至2.19±0.31倍(P<0.01),但ABCA1、LXRαmR NA水平無顯著變化。3.4高磷環(huán)境對VSMCs內(nèi)膽固醇代謝相關(guān)分子蛋白水平的影響
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本文編號：2892115