背景:長段周圍神經缺損修復仍是現階段臨床棘手問題,周圍神經再生障礙通常會導致長期的部分或全部感覺和/或運動障礙。目前周圍神經長距離缺損修復的金標準是自體神經移植,但這受供體神經來源的制約。神經導管(neural guidance conduit,NGC)可連接神經缺損的近端和遠端,為軸突再生提供了物理和/或生化線索而成為目前有希望成為替代自體移植的治療方案,導電性聚合物(conducting polymers,CPs)基功能化NGC通過維持電信號通路來增強神經再生,但是目前導電性聚合物受到其溶解性差、加工困難等缺點的限制,而難以廣泛應用,因此亟需開發(fā)新型外周神經修復導電性材料以促進神經再生。目的:本系列研究主要圍繞用于制備NGC的新型導電性材料展開相關探索。第一個實驗體系中選用碳納米管(carbon nanotubes,CNTs)摻雜的聚己內酯(poly(ε-caprolactone),PCL)通過靜電紡絲技術制作取向度可調的中空NGC,在充分表征PCL、PCL/CNTs的理化性能及對神經細胞的行為影響后對其體內促神經再生作用進行驗證。第二個實驗體系在此空心導管的基礎上進一步開發(fā)可溶性CP聚(3-噻吩乙酸)(poly(3-thiopheneacetic acid),PTAA)及單寧酸(tannic acid,Ta)摻雜的聚乳酸-羥基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA/PTAA/Ta,PPT)電紡纖維膜,并制作取向PPT(aligned-PLGA/PTAA/Ta,A-PPT)電紡纖維NGC。管腔填充物為搭載雪旺細胞(Schwann cells,SCs)的甲氧基聚乙二醇-聚丙氨酸-羧基化苯胺四聚體(mPEG-PLAla-CTA)溫敏性電活性水凝膠。充分表征支架及溫敏性電活性水凝膠的理化性質,體內、體外驗證該組織工程神經移植物(tissue-engineered nerve graft,TENG)協(xié)同電刺激(electrical stimulation,ES)促進神經修復效果,對其促神經再生機制進行探討。材料與方法:首先通過調整滾輪轉速制作取向度可調的PCL及PCL/CNTs靜電紡絲纖維膜,并對其行掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)、水接觸角、機械性能、熱行為、小角X射線散射(Small-angle X-ray scattering,SAXS)、電導率等表征。體外對腎上腺嗜鉻細胞瘤(pheochromocytoma,PC12)細胞的神經行為影響的基礎上,選擇最優(yōu)取向度的PCL/CNTs-1000 NGC用于大鼠坐骨神經10mm缺損模型,術后3個月對其進行運動功能評價、組織學評價、神經電生理及腓腸肌肌肉萎縮情況等評價其神經再生情況。TENG實驗中,首先通過3-噻吩乙酸單體經無水三氯化鐵化學氧化合成聚(3-噻吩乙酸甲酯)(poly(3-thiophene methyl acetate),PTMA),之后堿化水解得到PTAA,通過類似實驗一的方法制備A-PPT;通過氨基化的甲氧基聚乙二醇引發(fā)L-丙氨酸N-內羧酸酐開環(huán)聚合,得到甲氧基聚乙二醇-聚丙氨酸(mPEG-PLAla)二嵌段共聚物,mPEG-PLAla與羧基化苯胺四聚體(carboxyl-capped tetraaniline,CTA)發(fā)生氨基與羧基的縮合反應制備mPEG-PLAla-CTA水凝膠,對mPEG-PLAla-CTA水凝膠質子核磁共振、傅里葉變換紅外光譜、相圖、流變學、循環(huán)伏安(cyclic voltammetry,CV)曲線、體內體外降解等進行充分表征,體外實驗進行SCs的細胞毒性、粘附和增殖實驗。該TENG協(xié)同ES修復大鼠坐骨神經10 mm缺損實驗中,通過術后3個月對其進行運動功能評價、組織學評價、神經電生理及腓腸肌肌肉萎縮情況等評價其神經再生情況,并對再生神經組織中neurofilament-200(NF200)、髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)及膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein,GFAP)、β3-Tubulin(TUJ-1)蛋白表達通過免疫熒光進行半定量結果分析其促神經再生機制。結果:本研究成功制備了取向度可調的具備適宜的孔隙率、機械性能良好的導電性PCL/CNTs-1000 NGC,體外實驗證實其具備引導PC12細胞定向粘附、增殖能力,體內實驗中術后3個月運動功能評價結果:PCL/CNTs-1000,PCL/CNTs-0+ES和PCL/CNTs-0組的坐骨神經功能指數(sciatic functional index,)評分分別為-56.89±10.12,-54.69±5.42和-69.48±5.49,顯著低于自體移植組(-29.7±8.64)和PCL/CNTs-1000+ES組評分(-31.00±4.98);自體移植和PCL/CNTs-1000+ES組的軸突髓鞘較厚,分別為0.87±0.32和0.68±0.24μm,PCL/CNTs-1000+ES組的復合肌肉動作電位(compound muscle action potential,CMAP)潛伏期為1.33±0.06 ms與自體移植組(1.27±0.08 ms)相當,比PCL/CNTs-0組的(2.01±0.10ms)短。健康雄性大鼠、自體移植組及PCL/CNTs-1000+ES的CMAP振幅分別為12.87±0.55 mV、6.82±0.92 mV、6.74±0.28 mV。PCL/CNTs-1000+ES支架組與自體移植組相當,PCL/CNTs-1000+ES組的CMAP峰值(6.42±0.47 mV)遠高于PCL/CNTs-1000組的4.27±0.28 mV和PCL/CNTs-0組的3.48±0.77 mV);腓腸肌肌肉萎縮評價結果顯示PCL/CNTs-1000+ES組與自體移植組無統(tǒng)計學差異,橫截面肌纖維面積占比與自體移植組也無差異;NF200,MBP,GFAP和TuJ-1染色蛋白進行熒光強度半定量分析結果顯示蛋白在PCL/CNTs-1000+ES支架中的表達水平明顯高于其他組,且與自體移植組無差異。第二個實驗中,制備的A-PPT電紡纖維膜取向度良好,且具有較好的親水性,A-PPT電紡絲膜沿取向方向的電導率分別為(0.21±0.06)×10~(-3) S/m,垂直于取向方向的電導率為(0.08±0.02)×10~(-4) S/m;隨機方向PLGA/PTAA/Ta(R-PPT)電紡絲膜電導率為(0.32±0.09)×10~(-4) S/m;制備的管腔填充物mPEG-PLAla-CTA水凝膠成膠性能良好,流變測試顯示其儲能模量高于100 Pa,CV曲線顯示其具備穩(wěn)定電活性;體外降解實驗中分別于PBS,彈性蛋白酶,糜蛋白酶環(huán)境下30天后mPEG-PLAla-CTA降解為原重量的51.7±2.1%,35.0±2.6%,19.3±3.8%,體內降解實驗4周時間內無明顯炎癥反應出現;體外細胞實驗表明該電活性水凝膠及A-PPT電紡膜同時顯示協(xié)同ES對SCs無明顯細胞毒性,可促進SCs粘附與增殖。動物實驗中運動功能評價中Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組的SFI評分分別為-36.30±3.67,-38.12±4.18,-42.86±1.62,三組結果無統(tǒng)計學差異,說明術后3個月時A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組與Autograft組運動功能恢復效果相當;再生神經透射電鏡結果分析2500μm~2區(qū)域大小內再生神經軸突數量Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,平均值分別為101.2,96.0個,二者無統(tǒng)計學差異;Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組有髓軸突直徑統(tǒng)計結果4.8±0.5μm,4.2±0.4μm,二者無統(tǒng)計學差異;髓鞘厚度的統(tǒng)計結果Autograft組為1.1±0.2μm,A-PPT-Gel-SCs-ES組為0.8±0.1μm,無統(tǒng)計學差異。神經電生理結果顯示Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組CAMP振幅分別為:6.89±0.15 mV,6.79±0.10 mV,二者無統(tǒng)計學差異;Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組CAMP潛伏期分別為:1.26±0.09 ms,1.27±0.05 ms,二者無統(tǒng)計學差異;腓腸肌肌肉評價結果:Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組右側腓腸肌與健側腓腸肌重量比值結果分別為60.5±2.9%與64.2±2.6%,二者相比較結果無統(tǒng)計學差異;Masson染色圖像中橫截面膠原與肌纖維比值,Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組占比最小,平均值分別為9.3%與11.3%,二者無統(tǒng)計學差異;NF200,MBP,GFAP和TuJ-1染色蛋白進行熒光強度半定量分析結果顯示蛋白在PCL/CNTs-1000+ES支架中的表達水平明顯高于其他組,且與自體移植組無差異。結論:本研究開發(fā)的PCL/CNTs-1000 NGC及A-PPT NGC填充搭載SCs的mPEG-PLAla-CTA溫敏性導電水凝膠的TENG協(xié)同外源性ES,在大鼠坐骨神經缺損實驗中SFI評分、CAMP振幅及潛伏期、軸突及髓鞘厚度、腓腸肌肌肉萎縮等結果與自體移植相當,均可促進神經特異性蛋白NF200、MBP、GFAP和TuJ-1表達,說明該系列導電性NGC/TENG協(xié)同電刺激可有效針對外周缺損病理特點,取向導管通過物理引導作用實現軸突再生及髓鞘化,mPEG-PLAla-CTA溫敏性導電水凝膠其降解速率與神經再生相匹配,可在傷后早期為NGC提供物理支撐,降解后遺留的間隙為再生神經提供空間。協(xié)同外源性ES進一步提高了該系列NGC/TENG的神經修復效果,實現了周圍神經缺損后的運功功能、組織學、電生理方面的神經精準修復。PCL/CNTs-1000 NGC及A-PPT NGC填充搭載SCs的mPEG-PLAla-CTA溫敏性導電水凝膠的TENG的研發(fā)可有望提高極限修復長度,并最終取代自體神經移植。本系列研究的成功實施將提供一類可修復極限長度外周神經缺損的多功能組織工程神經移植物,將產生積極的經濟效益和社會效益。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R318.08
【部分圖文】：
術后3個月對大鼠進行運動功能評價,正常大鼠及Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組,A-PPT-Gel組,A-PPT組,R-PPT組,PLGA組的足印照片見圖3.16,自體神經移植組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組與正常大鼠足跡照片類似,1–5足趾及2–4足趾距離較寬,足跟至第三足趾距離較短,進一步的SFI定量分析圖表見圖3.17。單純PLGA組結果效果最差,SFI評分為-80.94±5.31,其結果與另外6組均有統(tǒng)計學差異;A-PPT-Gel組,A-PPT組,R-PPT組平均值分別為-51.98,-55.51,-67.23。A-PPT組結果優(yōu)于R-PPT組,證明取向神經導管對運動功能恢復的重要作用;A-PPT-Gel組與A-PPT組效果無差異,且效果均較差,證明NGC管腔內填充凝膠后尚需添加SCs,電刺激等因素進一步增強恢復運動功能能力;Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組的運動SFI評分分別為-36.30±3.67,-38.12±4.18,-42.86±1.62,三組結果無統(tǒng)計學差異,說明術后3個月時A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組與Autograft組運動功能恢復效果相當,如進一步延長實驗時間,A-PPT-Gel-SCs-ES組有望進一步恢復運動功能,甚至取得比Autograft組更好的運動功能效果。圖3.17術后3個月SFI評分結果(n=3;*與自體移植組比較p<0.05;#與A-PPT-Gel-SCs-ES組比較p<0.05;Δ與A-PPT-Gel-SCs組比較p<0.05;φ與A-PPT-Gel組比較p<0.05;ψ與A-PPT組比較p<0.05;ξ與R-PPT組比較p<0.05)。
圖3.16正常大鼠及Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組,A-PPT-Gel組,A-PPT組,R-PPT組,PLGA組的足印照片。3.4.3.2 再生坐骨神經組織學評價
術后3個月將電生理評價后大鼠行心臟灌注大鼠取神經標本,行H&E染色大鼠心臟灌注液為4%多聚甲醛PBS溶液;行甲苯胺藍染色、TEM制樣的大鼠心臟灌注液為2.5%戊二醛固定液。術中見各組再生神經均完整連接神經近端及遠端斷端,Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,A-PPT-Gel-SCs組再生神經瘢痕組織較少;A-PPT-Gel組,A-PPT組,R-PPT組,PLGA組瘢痕組織相對較多。再生神經的中段組織HE染色及TEM照片見圖3.18,由H&E染色結果可見,Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組組織量較多,可先新生血管生成,A-PPT組,R-PPT組,PLGA組組織量明顯減少;圖3.19 ABC分別為軸突數量、有髓軸突直徑、髓鞘厚度的統(tǒng)計結果。統(tǒng)計2500μm2區(qū)域大小內再生神經軸突數量Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組,平均值分別為101.2,96.0個。二者無統(tǒng)計學差異,說明ES對促進軸突再生有促進作用,A-PPT-Gel-SCs組,A-PPT-Gel組,A-PPT組,R-PPT組,PLGA組結果分別為80.9±3.1,58.33±3.3,49.8±2.9,30.7±2.6,31±1.3個,各組統(tǒng)計差異結果見圖3.19 A,可見取向電紡絲、mPEG-PLAla-CTA電活性水凝膠、SCs均可作為獨立因素促進軸突數量增加,但僅A-PPT-Gel-SCs-ES組與Autograft組無差異;Autograft組,A-PPT-Gel-SCs-ES組有髓軸突直徑統(tǒng)計結果4.8±0.5μm,4.2±0.4μm,二者無統(tǒng)計學差異,需要指出的A-PPT-Gel-SCs組,A-PPT-Gel組,A-PPT組是A-PPT-Gel-SCs-ES組均無統(tǒng)計學差異;髓鞘厚度的統(tǒng)計結果Autograft組為1.1±0.2μm,A-PPT-Gel-SCs-ES組為0.8±0.1μm,無統(tǒng)計學差異。通過以上分析可知PTAA神經導管結合填充搭載SCs的電活性水凝膠組織工程移植物可以有效促進軸突數量增加,增加有髓軸突直徑和髓鞘厚度。圖3.19術后3個月軸突數量、有髓軸突直徑、髓鞘厚度(n=3;*與自體移植組比較p<0.05;#與A-PPT-Gel-SCs-ES組比較p<0.05;Δ與A-PPT-Gel-SCs組比較p<0.05;φ與A-PPT-Gel組比較p<0.05;ψ與A-PPT組比較p<0.05)。
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本文編號：
2889817
