背景:侵襲性肺曲霉病是一種致死率較高的感染性疾病。急性白血病患者和造血干細胞移植曲霉菌感染患者的死亡率高達40%至50%。三唑類藥物是目前臨床上最主要的抗真菌藥物,而曲霉菌對三唑類藥物的耐藥率逐年增加,使得臨床上對曲霉菌感染的治療陷入困境。免疫調節(jié)聯合抗真菌治療被認為是最有潛力的疾病改善措施,但目前尚未發(fā)現有效的作用靶點。Toll樣受體7(TLR7)是一種位于細胞內的高度保守的固有免疫病原模式識別受體。TLR7最初被認為是識別病毒來源的單鏈RNA的受體。后有研究表明,除了病毒單鏈RNA外,TLR7還可以識別細菌釋放的核酸。而還有研究顯示,TLR7參與了白色念珠菌感染致病過程中免疫調節(jié);且有臨床研究表明,病人T淋巴細胞表面TLR7的表達水平與真菌感染呈負相關趨勢。近期有臨床研究報道TLR7的基因多態(tài)性與曲霉菌感染相關,但TLR7是否參與宿主抗曲霉菌感染的免疫反應過程尚未見報道。目的:本研究旨在明確TLR7在宿主抗曲霉菌感染免疫反應中的作用,闡明其發(fā)揮作用的機制,為開發(fā)曲霉菌感染的免疫治療方法提供新思路。方法:選取實驗室標準煙曲霉菌株AF293,經支氣管給藥的方式建立侵襲性曲霉菌肺部感染模型,Q-PCR檢測TLR7在不同感染時間點小鼠標本中的mRNA表達水平。建立免疫正常及免疫抑制兩種免疫狀態(tài)下野生(WT)和TLR7缺陷(TLR7~(-/-))小鼠曲霉菌感染模型,通過生存率實驗、肺曲霉菌載量測定,明確TLR7在曲霉菌感染中作用;并通過外源性給予小鼠TLR7特異性激動劑咪喹莫特(imiquimod,R837)處理,再次觀察小鼠生存率,驗證TLR7在曲霉菌感染中的作用。通過肺組織病理切片HE染色、PAS染色以及檢測肺干濕比、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中總蛋白水平,明確TLR7在曲霉菌感染后小鼠肺損傷中作用。采用流式細胞術(Flow cytometry,FCM)分類計數WT和TLR7~(-/-)曲霉菌感染小鼠BALF中炎癥細胞,采用ELISA檢測肺部炎癥細胞因子和趨化因子的表達水平,明確TLR7在曲霉菌感染中的免疫調控效應。分離培養(yǎng)在天然免疫抗菌防御中發(fā)揮重要作用的巨噬細胞和中性粒細胞,在體外通過吞噬殺傷實驗,評價TLR7對免疫細胞吞噬殺傷曲霉菌孢子功能的影響,明確TLR7在曲霉菌感染中發(fā)揮免疫調控作用的機制。通過巨噬細胞敲除實驗,明確巨噬細胞在曲霉菌感染宿主免疫防御中的作用。結果:1.TLR7在曲霉菌感染小鼠肺及脾組織中表達上調與對照組相比,在曲霉菌感染后12小時小鼠肺及脾組織中TLR7mRNA表達顯著上調,差異具有統(tǒng)計學意義(肺p0.05,脾p0.01)。2.TLR7在侵襲性肺曲霉病中發(fā)揮有害作用1)生存率實驗顯示,正常免疫狀態(tài)下,在高致死劑量的曲霉菌肺部感染模型中,WT小鼠全部死亡,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠生存率顯著提高(32%生存率,p0.001);在中等致死劑量的曲霉菌肺部感染模型中,WT小鼠全部死亡,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠生存率顯著提高(90%生存率,p0.001)。2)生存率實驗顯示,正常免疫狀態(tài)下,在低致死劑量的曲霉菌感染WT小鼠中,與對照組相比,R837處理組小鼠全部死亡,生存率顯著降低(降低30%,p0.05);在相同感染劑量的TLR7~(-/-)小鼠中,R837處理組小鼠及對照組小鼠生存率均為90%,TLR7~(-/-)小鼠生存率顯著高于野生小鼠(p0.001),且當TLR7缺陷時,R837處理并未降低曲霉菌感染小鼠生存率(p0.05)。3)生存率實驗顯示,免疫抑制時,經致死劑量的曲霉菌肺部感染后,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠生存率顯著提高(提高54%,p0.01),與正常免疫狀態(tài)的結果一致。3.TLR7缺陷使機體對曲霉菌的清除能力增強1)通過肺部病原載量分析,正常免疫狀態(tài)下,曲霉菌感染后第1天及第3天,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠肺組織中真菌載量顯著降低(p0.01),真菌清除能力增強;肺組織切片標本經糖原染色后,可見TLR7~(-/-)小鼠曲霉菌孢子較WT小鼠少。2)通過肺部病原載量分析,免疫抑制時,曲霉菌感染后第3天,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠肺組織中真菌載量顯著降低(p0.05),真菌清除能力增強,與正常免疫狀態(tài)的結果一致。4.TLR7缺陷使曲霉菌感染小鼠肺損傷減輕1)肺組織病理學切片HE染色結果顯示,野生小鼠肺部出現嚴重壞死、肺泡結構破壞、上皮細胞脫落、出血和大量的炎癥細胞浸潤,TLR7~(-/-)小鼠病理損傷范圍小,損傷較野生小鼠減輕。2)肺干濕比及BALF總蛋白檢測結果顯示,在感染后第1天,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠肺濕重/干重比值顯著降低(p0.01),感染后第3天,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠BALF中總蛋白含量顯著降低(p0.05)。5.TLR7缺陷使曲霉菌感染小鼠肺部炎癥細胞募集減少1)通過牛鮑計數板計數BALF中的WBC數目發(fā)現,曲霉菌感染后3天,與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠BALF中白細胞總數顯著減少(p0.05)。2)經FCM對BALF中白細胞分類計數發(fā)現,曲霉菌感染后3天,TLR7~(-/-)小鼠BALF中CD11b~+F4/80~+巨噬細胞比例增加(23%vs 14%),CD11b~+Ly6G~+中性粒細胞比例無顯著差異。與WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠BALF中性細胞絕對值顯著降低(p0.05),而巨噬細胞的絕對計數無顯著差異。6.TLR7缺陷導致曲霉菌感染后炎癥細胞因子水平顯著降低而CCL2顯著增高通過ELISA檢測肺炎癥細胞因子和趨化因子水平發(fā)現,與野生小鼠相比,在感染后1天,TLR7~(-/-)小鼠肺勻漿中,炎癥細胞因子IL-6(p0.01)及中性細胞趨化因子CXCL1(p0.05)水平顯著降低;在感染后3天,IL-17A水平顯著降低(p0.05),巨噬細胞趨化因子CCL2表達顯著上調(p0.05)。而其他細胞因子(TNF-a、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-27、IFN-a及IFN-γ)的水平無顯著差異。7.TLR7缺陷使巨噬細胞吞噬殺傷功能增強但不影響中性粒細胞吞噬殺傷功能體外分離培養(yǎng)小鼠巨噬細胞和中性粒細胞,吞噬殺傷實驗顯示,來自TLR7~(-/-)小鼠的原代巨噬細胞與來自WT小鼠原代巨噬細胞相比,吞噬、殺傷孢子功能顯著增強(p0.05),兩組小鼠原代中性粒細胞吞噬、殺傷孢子功能無顯著差異。8.巨噬細胞在曲霉菌感染宿主免疫防御中發(fā)揮重要作用生存率結果表明,與對照組相比,巨噬細胞敲除后WT小鼠生存率顯著降低(降低約31%,p0.05)。結論:TLR7在侵襲性肺曲霉病動物模型中表達顯著增高,并發(fā)揮了免疫損害作用。初步闡明了其作用機制,即TLR7通過抑制巨噬細胞的吞噬殺傷孢子功能,抑制機體清除曲霉菌孢子,進一步誘導炎癥反應,促進炎癥細胞募集,促進炎癥因子及趨化因子的分泌,加重肺損傷,引起曲霉菌感染小鼠死亡率增高,TLR7~(-/-)小鼠曲霉菌清除作用增強,肺損傷減輕,生存率提高。這些結果提示,TLR7是一個良好的治療曲霉菌感染的免疫干預靶點。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R519
【部分圖文】：

為探究TLR7是否可在曲霉菌感染中發(fā)揮免疫調節(jié)作用,我們采用煙曲霉菌標準菌株AF293,經支氣管滴注的方式,建立了侵襲性肺煙曲霉菌感染模型。分別于感染的0 h、6 h、12 h、24 h、72 h,收集小鼠肺及脾組織,提取RNA,經Q-PCR檢測TLR7的mRNA水平,結果顯示與PBS對照組相比,曲霉菌感染后6小時小鼠肺組織、脾組織中TLR7 mRNA表達顯著上調(圖1,肺p<0.05,脾p<0.001),提示TLR7可能在曲霉菌感染中發(fā)揮免疫調節(jié)作用。3.2 TLR7在曲霉菌感染中發(fā)揮免疫損害作用

為探索TLR7在曲霉菌感染中的作用,我們采用高致死劑量(1.25×108CFU/只)和中等致死劑量(1.05×108CFU/只)的曲霉菌分別建立侵襲性肺曲霉菌感染模型,在不同程度致死劑量下,分別建立WT和TLR7-/-小鼠曲霉菌感染模型后,觀察小鼠14天生存率、小鼠狀態(tài)和體重變化。結果顯示:在高致死劑量的曲霉菌感染模型中,WT小鼠生存率為0%時,TLR7-/-小鼠生存率為31.82%,與WT小鼠相比,TLR7-/-小鼠生存率顯著提高(p<0.001,圖2.1 A);在中等致死劑量的曲霉菌感染模型中,WT小鼠生存率為0%時,TLR7-/-小鼠生存率為高達90%,與WT小鼠相比,TLR7-/-小鼠生存率顯著提高(p<0.001,圖2.1 B)。以上結果提示TLR7在曲霉菌性肺炎中發(fā)揮免疫損害作用。3.2.2 TLR7激動劑處理曲霉菌感染小鼠生存率顯著降低

為了進一步驗證TLR7在曲霉菌感染中的免疫損害作用,我們建立了低致死劑量(9.5×107CFU/只)曲霉菌感染模型,并采用TLR7激動劑R837(imiquimod)分別處理曲霉菌感染WT和TLR7-/-小鼠,PBS處理組為對照組。如圖2.2所示,在曲霉菌感染的野生小鼠中,R837處理組小鼠生存率為0%,無內毒素H2O對照組生存率為30%,與對照組相比,R837處理組小鼠生存率顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05);在相同感染劑量的曲霉菌感染后的TLR7-/-小鼠中,R837處理組小鼠生存率為90%,無內毒素H2O對照組生存率為90%,TLR7-/-小鼠生存率顯著高于野生小鼠(p<0.001),且當TLR7缺陷后,R837處理并未降低曲霉菌感染小鼠生存率(p>0.05)。以上結果從正向驗證了TLR7在曲霉菌性肺炎中發(fā)揮免疫損害作用。3.2.3 TLR7缺陷顯著提高免疫抑制狀態(tài)下曲霉菌感染小鼠生存率
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本文編號：2882785