發(fā)布時間：2020-11-12 22:12

　　 目的認知障礙是糖尿病引起中樞神經系統(tǒng)損害的常見表現(xiàn)之一,其發(fā)生發(fā)展機制尚未完全闡明。流行病學研究表明,2型糖尿病(Type 2diabetes mellitus,T2DM)患者更容易發(fā)生阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD),反之亦然。同時,T2DM與AD之間存在許多共同的病理特點,如胰島素抵抗、氧化應激損傷、線粒體功能障礙、膽固醇代謝異常、炎癥因子浸潤、淀粉樣蛋白異常沉積等。近年來,基于人群的全基因組關聯(lián)研究(Genome-Wide Association Studies,GWAS)發(fā)現(xiàn)小膠質細胞2型髓樣細胞觸發(fā)受體(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)錯義突變導致小膠質細胞功能異常是AD發(fā)生發(fā)展的重要機制。然而,小膠質細胞TREM2在糖尿病認知障礙中是否存在重要作用尚無相關研究報道。本課題旨在通過體內、體外實驗探討TREM2對小膠質細胞炎癥反應和極化表型的調控作用,及其在糖尿病認知障礙小鼠中的作用及機制。方法體外實驗:通過質粒轉染BV-2細胞建立TREM2過表達和干擾細胞模型,并通過脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)干預建立炎癥刺激細胞模型。細胞模型分為空白對照組(Con)、LPS+vector組、LPS+TREM2-OE組、LPS+TREM2-shRNA組。在mRNA水平,通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)檢測細胞炎癥相關分子mRNA表達水平的變化,以及M1、M2型小膠質細胞標志物的變化;免疫印跡實驗(Western blot,WB)檢測NF-κB通路相關蛋白表達情況;細胞免疫熒光(Immunofluorescence,IF)雙標實驗分別檢測M1、M2極化表型標志物蛋白水平變化。體內實驗:雄性C57BL/6J小鼠予以高脂飲食(High-fat diet,HFD)喂養(yǎng)50周以建立糖尿病認知障礙的動物模型,對照組小鼠則予以普通飲食(Normal chow diet,NCD)喂養(yǎng)。飲食喂養(yǎng)干預38周后,通過腦立體定位注射CD68啟動子的TREM2過表達腺相關病毒(Adeno-associated virus,AAV)使雙側海馬小膠質細胞TREM2過表達。實驗小鼠根據(jù)注射TREM2過表達病毒(AAV-TREM2)和對照病毒(AAV-con)分為NCD-con組、HFD-con組、HFD-TREM2組。定位注射10周后,通過莫里斯水迷宮(Morris water maze,MWM)、Y迷宮(Y maze)、新事物識別實驗(Novel object recognition,NOR)分別評估小鼠學習、空間記憶、識別記憶功能的變化;腹腔葡糖耐量實驗(Intraperitoneal glucose tolerance test,ipGTT)明確小鼠葡萄糖代謝改變。高爾基染色(Golgi stain)分析海馬CA1區(qū)錐體神經元樹突分枝結構復雜性、頂樹突樹突棘密度;透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)觀察突觸超微結構;WB檢測海馬組織突觸相關蛋白synaptophysin、PSD95、spinophilin的表達水平。qPCR檢測小鼠海馬炎癥相關因子及M1、M2型小膠質細胞標志物的mRNA表達水平;WB檢測海馬NF-κB炎癥通路激活情況;鼠腦冰凍切片免疫熒光雙標分析海馬M1、M2型小膠質細胞極化情況,并通過Image J分析小膠質細胞形態(tài)明確小膠質細胞炎癥激活的水平。結果體外細胞實驗表明,BV-2細胞在LPS刺激下TREM2表達水平降低,腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)的mRNA表達水平增加。LPS+TREM2-OE組,上述促炎因子表達明顯下調,同時M2型小膠質細胞標志物精氨酸合酶-1(Arginase-1,Arg-1)、YM1/2明顯升高;相反,LPS+TREM-shRNA組,促炎因子表達明顯上調,M2型小膠質細胞標志物明顯降低。細胞免疫熒光提示TREM2抑制M1型小膠質細胞標志物iNOS蛋白表達水平,增加M2型小膠質細胞標志物CD206蛋白表達水平。同時,TREM2過表達明顯抑制了LPS刺激下BV-2細胞NF-κB通路p-p65、p-ikb-α的蛋白表達,而TREM2干擾則相反。動物實驗表明,海馬過表達TREM2改善了長期HFD誘導的小鼠學習、空間記憶和識別記憶,表現(xiàn)為MWM實驗中潛伏期縮短、隱藏平臺穿越次數(shù)增加、目標象限游泳路程占總游泳路程比值增加,Y迷宮實驗中自發(fā)交替頻率增加,NOR實驗中新事物偏好指數(shù)增加。長期HFD喂養(yǎng)使小鼠海馬神經元樹突結構受損,而相對于HFD-con組,HFD-TREM2組小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經元樹突結構復雜性和頂樹突樹突棘密度均增加,突觸相關蛋白Synaptophysin、PSD95、Spinophilin表達增加,突觸超微結構更加完整。HFD促使小鼠海馬小膠質細胞大量激活及炎癥反應加劇,與HFD-con組小鼠相比,HFD-TREM2組海馬炎癥反應改善,IL-1β、TLR-4的mRNA表達水平下降,M2型標志物Arg-1、YM1/2的表達水平升高;同時,p-p65、p-ikb-α表達下降,NF-κB通路的激活受抑制。TREM2過表達使HFD誘導的海馬阿米巴樣激活態(tài)小膠質細胞數(shù)量減少,分枝狀的靜息態(tài)小膠質細胞增加,M1型小膠質細胞(iba-1~+/iNOS~+)減少,M2型小膠質細胞(iba-1~+/Arg-1~+)增多。結論海馬小膠質細胞TREM2過表達可改善長期HFD誘導的糖尿病認知障礙小鼠海馬錐體神經元樹突及突觸損傷,增加突觸相關蛋白表達,并最終改善其認知損害,其機制與TREM2促進小膠質細胞向M2型極化,抑制小膠質細胞激活,抑制NF-κB通路激活和炎癥反應有關。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R587.2;R749.1
【部分圖文】：

BV-2細胞系是通過癌基因改建原代培養(yǎng)小鼠小膠質細胞而獲得的永生細胞系,其形態(tài)學、表型及炎癥反應等各項功能特點與小鼠原代小膠質細胞相似。為了驗證BV-2細胞在炎癥刺激下TREM2的變化趨勢,以及在胰島素抵抗狀態(tài)下,TREM2的表達是否發(fā)生改變,我們分別使用LPS刺激的細胞炎癥模型和高濃度胰島素刺激的胰島素抵抗細胞模型來進行驗證。qPCR結果顯示,100ng/ml和1000ng/ml的LPS刺激24小時均可引起B(yǎng)V-2細胞TREM2的mRNA表達水平明顯下降,且濃度越高,下降越顯著(圖1.1 A,P<0.05)。隨后,我們通過WB檢測p-Akt的水平來判斷胰島素抵抗是否發(fā)生,與10nM正常濃度胰島素處理BV-2細胞相比,2μM高濃度胰島素干預細胞后,其p-Akt/Akt的比值明顯降低,提示BV-2細胞出現(xiàn)胰島素抵抗(圖1.1 B,P<0.05)。qPCR結果提示10nM正常濃度胰島素干預后,TREM2表達無明顯改變,而在胰島素抵抗情況下,TREM2表達下降(圖1.1 C,P<0.05)。因此,在上述細胞模型中,我們初步明確,TREM2的m RNA水平在炎癥刺激和胰島素抵抗狀態(tài)下均下調。2.2 TREM2抑制BV-2細胞的炎癥反應及NF-κB通路的激活

為了探討TREM2是否具有調控BV-2細胞炎癥反應的作用,我們通過質粒轉染成功建立了TREM2過表達(TREM2-OE)和干擾(TREM2-shRNA)的BV-2細胞模型,質粒轉染效率超過90%(圖1.2 A-C)。100ng/ml LPS刺激下,BV-2細胞明顯增加了TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的m RNA表達水平,提示炎癥反應增加(圖1.2 D-G,P<0.05)。TREM2-OE抑制了LPS刺激下TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的mRNA表達,而TREM2-shRNA則促進了上述炎癥因子mRNA的表達(圖1.2 D-G,P<0.05)。通過該實驗提示TREM2具有抑制BV-2細胞炎癥反應的作用。那么,TREM2抑制炎癥的作用是通過什么通路來實現(xiàn)的呢?為此,結合文獻報道,我們對NF-κB通路的激活進行驗證,結果顯示TREM2-OE抑制了p65和ikb-α的磷酸化,而TREM2-shRNA則使其磷酸化增加(圖1.2 H,P<0.05)。提示,TREM2可通過抑制NF-κB通路的激活,從而改善炎癥反應。圖1.2 TREM2抑制LPS刺激下BV-2細胞的炎癥反應及NF-κB通路的激活。

TREM2抑制LPS刺激下BV-2細胞的炎癥反應及NF-κB通路的激活。
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本文編號：2881301