本文關鍵詞：Spag6基因敲除對小鼠內耳和中耳的影響及相關機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分Sperm-Associated Antigen 6 (Spag6)基因敲除致小鼠內耳極性缺陷和聽力損失目的Sperm-Associated Antigen 6 (Spag6)基因編碼中心微管蛋白,對纖毛和鞭毛的運動十分重要。最近研究發(fā)現,Spag6對纖毛的發(fā)生、調節(jié)纖毛小根的排列方向和細胞的平面極性十分重要。內耳聽覺上皮具有聽覺形成所需要的獨特結構,呈現最典型的平面極性,然而,Spag6在內耳是否有作用目前尚未見報道。本研究使用Spag6基因敲除小鼠探究Spag6在小鼠內耳中的作用。方法1.聽性腦干反應(auditory brainstem response, ABR)和耳蝸微音電位(cochlear microphonics, CM)分別檢測同窩Spag6+/+和Spag6-/小鼠的聽力。ABR使用click聲和短純音分別進行刺激；CM使用click聲進行刺激,記錄結果。2.對內耳基底膜進行鋪片及免疫熒光染色,顯示毛細胞表皮板下的微管系統(tǒng),觀察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的微管系統(tǒng)有無不同。3.對出生1天的同窩Spag6+/+和Spag6-/-小鼠耳蝸基底膜進行鋪片,行免疫熒光染色,觀察核心極性蛋白FZD6的分布有無不同。4.對內耳基底膜進行鋪片及免疫熒光染色,觀察Spag6+/+和.Spag6-/-小鼠內耳毛細胞的形態(tài)和極性,并對纖毛束的偏移角度進行統(tǒng)計。5.內耳基底膜行免疫熒光染色和掃描電鏡,觀察Spag6+/+和.Spag6-/-小鼠內耳毛細胞的一對中心粒、動纖毛和纖毛束三者之間的位置關系,并對動纖毛相對于纖毛束的偏移角度進行統(tǒng)計。結果1.Spag6+/+小鼠聽力結果：ABR的click聲刺激反應平均閾值為30.00±2.21 dB,ABR純音刺激4k.8k.16k.32kHz的聽力閾值分別為63.33±2.20、37.78±2.78、32.22±2.78和72.22±1.47dB,CM平均閾值40±4.08dB；spag6-/-小鼠聽力結果：ABR的click聲刺激反應平均閾值70.71±4.14 dB,ABR純音4k.8k.16k.32kHz的聽力閾值分別為85.71±2.29、74.29±2.97、72.86±3.60和90dB,三只純合小鼠CM在80dB均無法引出。Spag6+/+小鼠和Spag6-/-小鼠的ABR及CM結果均具有明顯統(tǒng)計學差異。2.Spag6+/+小鼠毛細胞表皮板的微管系統(tǒng),以中心粒和動纖毛為中心,向細胞質放射狀排列。而Spag6-/-小鼠毛細胞表皮板的微管系統(tǒng)發(fā)生了改變,微管排列錯亂,并隨動纖毛和中心粒的移位發(fā)生了偏移。3. Spag6+/+j小鼠的核心極性蛋白FZD6呈極性分布：；而Spag6-/-小鼠FZD6蛋白分布失去極性,在細胞膜上隨機分布。4.Spag6+/+小鼠基底膜毛細胞的一排內毛細胞和三排外毛細胞排列整齊,“八”字形纖毛束開口方向朝向內側,即耳蝸神經的方向；耳蝸基底膜寬度由頂轉向底轉變窄。而Spag6-/-小鼠的毛細胞大量積聚在耳蝸的頂轉區(qū)域,聽覺上皮區(qū)域明顯變寬；同時Spag6-/-小鼠毛細胞纖毛的極性發(fā)生了很大偏移,表現為方向各異。5.Spag6+/+小鼠的一對中心粒所在直線與組織極性軸平行,動纖毛位于纖毛束“八”字形的頂點。而Spag6-/-小鼠的一對中心粒所在的直線不再與組織極性軸平行,動纖毛與纖毛束的相對位置關系發(fā)生改變。結論Spag6基因缺失可使小鼠聽力損失,這種作用可能是通過參與調節(jié)小鼠內耳聽覺上皮的平面極性實現的。第二部分Sperm-Associated Antigen 6 (Spag6)基因敲除導致小鼠出現中耳炎目的Sperm-Associated Antigen 6 (Spag6)基因編碼中心微管蛋白,對纖毛和鞭毛的運動十分重要。最近研究發(fā)現,.Spag6對纖毛的發(fā)生、纖毛小根排列的方向和平面細胞極性的調節(jié)十分重要。極性排列的纖毛對中耳的正常功能具有重要意義,可以抵御細菌感染和清除中耳分泌物；纖毛結構或功能異�？蓪е轮卸�。然而,Spag6基因對于中耳的作用至今未見報道。本研究利用Spag6基因敲除小鼠,探討Spag6基因缺失對小鼠中耳的影響。方法1. RT-PCR和免疫熒光檢測Spag6在Spag6+/+和Spag6-/-小鼠中耳的表達。2.耳鏡觀察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的鼓膜和中耳腔,制作HE切片染色判斷中耳炎的發(fā)生情況。3.灌注固定后取Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的中耳及咽鼓管的纖毛上皮,使用掃描電鏡觀察纖毛情況。4.透射電鏡觀察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的中耳及咽鼓管的纖毛小根及一對中心微管的方向。5.對Spag6+/+和Spag6+/-小鼠的中耳粘膜上皮進行鋪片和免疫熒光染色,觀察核心極性蛋白FZD6的分布情況。6.分別使用細菌培養(yǎng)、菌落計數、PCR鑒定、粘液卡紅染色、Realtime-PCR、咽鼓管角度測量的方法,分別觀察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠中耳的細菌情況、杯狀細胞的分布情況、粘液因子Mucin5ac和Mucin5b的表達情況以及咽鼓管角度是否異常。結果1. RT-PCR和免疫熒光染色結果顯示：Spag6在Spag6+/+小鼠中耳和咽鼓管的纖毛上皮有表達且表達于纖毛；RT-PCR和免疫熒光均未檢測到Spag6基因在Spag6-/-小鼠的中耳或咽鼓管有表達。2.耳鏡顯示1月齡Spag6+/-小鼠鼓膜完好光滑,光錐明顯,中耳腔未見異常；而同窩Spag6-/-小鼠透過鼓膜可見氣泡及積液；HE切片染色顯示Spag6-/-小鼠中耳腔及咽鼓管內有滲出液體和炎性細胞,6月齡小鼠出現鼓室硬化,同窩Spag6+/+小鼠鼓室腔未見明顯異常。3.掃描電鏡顯示生后25天Spag6-/-小鼠的鼓室上皮纖毛出現倒伏錯亂,部分區(qū)域稀疏；而野生型小鼠纖毛密度未見降低,纖毛方向一致；Spag6-/-小鼠的骨岬的纖毛已經喪失,而Spag6+/+小鼠仍然存在。4.透射電鏡顯示Spag6-/-小鼠中耳上皮的纖毛小根方向錯亂,纖毛的一對中心微管所在直線方向不一致；而Spag6+/+小鼠纖毛小根的方向一致,所有纖毛的一對中心微管所在直線平行,基本指向同一方向。5.免疫熒光染色顯示FZD6蛋白在Spag6+/+小鼠中耳的纖毛上皮細胞的胞膜上呈極性分布,而FZD6蛋白在Spag6-/-小鼠的分布則失去極性。6.細菌培養(yǎng)、菌落計數和使用PCR鑒定小鼠中耳鼓室細菌顯示,Spag6+/+和Spag6-/-小鼠中耳腔中均存在卡他莫拉菌,且菌落數量無明顯統(tǒng)計學差異；粘液卡紅染色顯示Spag6-/-小鼠的杯狀細胞較Spag6+/+小鼠未見明顯增多；realtime-PCR顯示粘液因子Mucin5ac和Mucin5b的mRNA在Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的中耳表達無明顯差異；咽鼓管角度測量顯示Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的咽鼓管角度無明顯統(tǒng)計學差異。結論Spag6基因缺陷可導致Spag6-/-小鼠出現中耳炎,這可能是由于中耳上皮纖毛的結構和擺動方向出現異常；而纖毛結構和擺動方向異�？赡苁怯捎赟pag6基因參與了中耳上皮極性的調節(jié)和Spag6缺失影響了這種極性調節(jié)所致。
【關鍵詞】：精子相關抗原6 聽力 毛細胞 平面細胞極性 內耳 精子相關抗原6 中耳 咽鼓管 平面細胞極性 中耳炎
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R764
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-16
• 符號說明16-17
• 前言17-21
• 第一部分：Sperm-Associated Antigen 6(Spag6)基因敲除致小鼠內耳極性缺陷和聽力損失21-32
• 研究背景21-22
• 材料方法22-25
• 實驗結果25-30
• 討論30-31
• 結論31-32
• 第二部分：Sperm-Associated Antigen 6(Spag6)基因敲除導致小鼠出現中耳炎32-50
• 研究背景32-33
• 材料方法33-39
• 實驗結果39-48
• 討論48-49
• 結論49-50
• 參考文獻50-57
• 致謝57-58
• 攻讀學位期間發(fā)表論文58-59
• 英文附文一59-78
• 英文附文二78-101
• 附件101

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