結直腸癌(colorectal cancer, CRC)作為消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,全球每年新發(fā)病例超過120萬,并且每年約有60萬人死于CRC。手術切除原發(fā)性腫瘤是治療結直腸癌的首選方式,但手術后因感染誘發(fā)的炎癥反應及腫瘤遠端轉移是導致CRC患者預后較差的主要原因。腫瘤轉移是一個多因素、多基因參與的過程,包括細胞與細胞間的粘附降低、細胞與細胞外基質的粘附能力增強、基質金屬蛋白酶降解細胞外基質等。其中,細胞遷移和粘附是腫瘤遷移能力的重要指標。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作為革蘭氏陰性菌外膜上的一種糖蛋白,可引起全身炎癥反應和嚴重敗血癥,與CRC術后腹內(nèi)感染并發(fā)癥有關。結直腸癌患者手術后,LPS含量會明顯上升并引起炎癥反應。然而LPS在CRC進程中的明確作用目前仍不清楚。因此,研究CRC粘附、轉移及炎癥微環(huán)境改變誘導CRC惡性轉化的分子機理,對減少CRC患者的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。無論氧氣存在與否,腫瘤細胞主要依賴糖酵解而不是氧化磷酸化進行葡萄糖代謝,這一糖代謝異�，F(xiàn)象稱為Warburg效應。目前認為,M2型丙酮酸激酶在Warburg效應中發(fā)揮著重要作用。丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PK)作為糖酵解途徑的限速酶,能夠將磷酸烯醇式丙酮酸轉變成丙酮酸。PKM1和PKM2作為PK最為常見的兩個亞型,由PKM基因經(jīng)選擇性剪接產(chǎn)生。PKM1蛋白主要在除了肝、腎和血紅細胞之外的正常細胞中高表達,而PKM2蛋白則在干細胞和腫瘤細胞中高表達。PKM1具有穩(wěn)定的四聚體結構,不受別構調節(jié)。PKM2受到別構調控,并在腫瘤細胞內(nèi)發(fā)生二聚體和四聚體間轉化。PKM2四聚體具有較高的丙酮酸激酶活性,而二聚體形式則具有蛋白激酶活性,兩種活性的轉換為腫瘤細胞提供生長優(yōu)勢和對微環(huán)境的適應能力。已有報道顯示,PKM2在腫瘤細胞增殖、惡性轉化、血管生成和細胞周期進展中發(fā)揮著重要作用。然而,PKM1和PKM2在結腸癌細胞粘附、轉移及炎癥微環(huán)境的作用仍不明確。本文通過構建穩(wěn)定敲低PKM的DLD1細胞株以及穩(wěn)定過表達PKM1、PKM2及PKM2不同活性突變體的DLD1細胞株,分別探討了PKM1與PKM2在結腸癌細胞遷移與粘附、炎癥因子分泌與增殖調控中的作用與機制；通過原核表達GST-PKM1、 GST-PKM2融合蛋白來模擬分泌型PKM1和PKM2,檢測其對結腸癌細胞遷移能力的影響并探討其作用機制。獲得以下研究結果：1.通過構建敲低PKM、過表達PKM1、PKM2以及過表達PKM2的K367M、R399E和K433E等突變體的慢病毒表達載體。采用慢病毒包裝、收獲、轉染結腸癌DLD1細胞,經(jīng)puromycin篩選、qPCR和western blot技術檢測,得到穩(wěn)定細胞株。2.通過細胞劃痕法和細胞基質粘附實驗,我們發(fā)現(xiàn)過表達PKM2,而不是PKM1,能夠明顯促進結腸癌細胞遷移及粘附。qPCR和western blot結果顯示,過表達PKM2能明顯提高N-cadherin、MMP-2、MMP-9、Snail-2的表達,促進FAK的磷酸化以及β1-integrin的活化,并抑制E-cadherin的表達。敲低PKM能明顯逆轉PKM2誘導的遷移粘附相關信號分子的表達。特別是過表達PKM2能夠上調STAT3的mRNA水平、蛋白水平、磷酸化水平以及STAT3的核轉位。放線菌素D實驗顯示,PKM2上調STAT3的表達主要是通過調控其轉錄水平,而不是通過抑制mRNA降解。在過表達PKM2的細胞株中瞬時敲低STAT3的表達,結果表明,敲低STAT3能夠有效逆轉PKM2誘導的遷移粘附相關信號分子的表達及細胞遷移。通過檢測PKM2不同活性點突變的穩(wěn)定細胞株中丙酮酸激酶活性、STAT3的表達和磷酸化水平以及細胞遷移能力,發(fā)現(xiàn)DLD1-R399E細胞缺乏丙酮酸激酶活性,能明顯增加STAT3和磷酸化STAT3的表達,促進結腸癌細胞遷移。3.LPS可以明顯促進DLD1細胞中PKM2、TNF-α、IL-1β的表達,并具有濃度依賴性,而PKM1的表達不受LPS影響。同時發(fā)現(xiàn)LPS可以促進DLD1細胞增殖。Western blot、qPCR、ELISA以及MTT結果顯示,敲低PKM能夠抑制LPS誘導的TNF-α、IL-1β的表達、分泌以及結腸癌細胞增殖。過表達PKM2可以明顯促進TNF-αIL-1β的表達以及LPS誘導的結腸癌細胞增殖。NF-κB的抑制劑BAY-11-7082能夠明顯抑制LPS誘導的NF-κB亞基p65、PKM2的表達。敲低PKM能顯著抑制LPS誘導的STAT3的表達和核轉位,而對LPS誘導的p65的表達和核轉位無影響。在過表達PKM2細胞中瞬時敲低STAT3,可以逆轉由PKM2引起的TNF-a和IL-1β的表達。染色質免疫共沉淀結果顯示,LPS能促進PKM2與STAT3啟動子的結合,通過促進STAT3的轉錄來調控TNF-α、IL-1β的表達。DLD1-R399E細胞能明顯促進STAT3的表達和]TNF-α、IL-1β的分泌。4.通過原核表達純化GST-PKM1、GST-PKM2處理DLD1細胞模擬分泌型PKM1、PKM2的功能,發(fā)現(xiàn)分泌型PKM2能促進結腸癌細胞遷移。敲低PKM2能明顯減少PKM2的分泌及由分泌型PKM2誘導的結腸癌細胞遷移。分泌型PKM2能促進MMP-2、MMP-9、N-cadherin、β、catenin勺表達,抑制E-cadherin的表達。分泌型PKM2能夠促進Akt的磷酸化,而PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002能抑制分泌型PKM2誘導的結腸癌細胞遷移及E-cadherin、N-cadherin和β-catenin的表達。采用siRNA干擾β-catenin表達,可以明顯逆轉分泌型PKM2誘導的E-cadherin、 N-cadherin的表達。綜上所述：PKM2依賴其蛋白激酶活性而不是丙酮酸激酶活性,調控STAT3轉錄,促進結腸癌細胞遷移和粘附。LPS通過誘導PKM2表達、增強PKM2與STAT3基因啟動子結合、加強STAT3的表達與核轉位,調控結腸癌細胞TNF-a和IL-1p的表達與分泌。分泌型PKM2能通過PI3K/Akt和β-catenin信號通路促進結腸癌細胞遷移。因此,PKM2在結腸癌細胞遷移、粘附、炎癥因子的分泌調控中發(fā)揮著重要作用,可作為結直腸癌轉移和術后炎癥反應診治的靶點。
【學位單位】：山西大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R735.35
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1 Warburg效應與PKM2
    2 PKM2概述
        2.1 PKM2的表達調控
            2.1.1 PKM的表達調節(jié)
            2.1.2 PKM基因的選擇性剪接
            2.1.3 表觀遺傳及microRNA調控
            2.1.4 PKM2蛋白穩(wěn)定性調控
        2.2 PKM2的活性調控
            2.2.1 代謝中間產(chǎn)物對PKM2的活性調控
            2.2.2 翻譯后修飾對PKM2的活性調控
        2.3 PKM2對腫瘤代謝的調控
        2.4 PKM2對細胞信號通路的調控
        2.5 PKM2的臨床應用
    3 本課題的研究意義及研究內(nèi)容
第二章 PKM1和PKM2不同活性突變體的穩(wěn)定表達細胞株的建立
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 細胞、菌株與質粒
            2.1.2 試劑與抗體
            2.1.3 主要試劑配制方法
            2.1.4 主要儀器設備
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)
            2.2.2 細胞的凍存與復蘇
            2.2.3 RNA提取、反轉錄cDNA
            2.2.4 PKM1、PKM2慢病毒表達載體的構建
            2.2.5 PKM2不同點突變慢病毒載體K367M、R399E和K433E的構建
            2.2.6 穩(wěn)定敲低PKM慢病毒載體的構建
            2.2.7 慢病毒包裝
            2.2.8 DLD1細胞株轉染和篩選
            2.2.9 熒光定量PCR和western blot鑒定穩(wěn)定細胞株
    3 結果
        3.1 穩(wěn)定敲低PKM的結腸癌細胞株的獲得及檢測
        3.2 穩(wěn)定過表達PKM1、PKM2的結腸癌細胞株的獲得及檢測
        3.3 PKM2不同活性突變體的穩(wěn)定過表達細胞株的獲得及檢測
    4 討論
第三章 PKM2過表達影響結腸癌細胞遷移與粘附的分子機制
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 細胞、菌株與質粒
            2.1.2 試劑與抗體
            2.1.3 主要試劑配制方法
            2.1.4 主要儀器設備
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)
            2.2.2 實時定量PCR分析
            2.2.3 細胞漿蛋白、核蛋白抽提和western blot分析
            2.2.4 細胞劃痕實驗
            2.2.5 細胞基質粘附實驗
            2.2.6 siRNA轉染敲低STAT3
            2.2.7 丙酮酸激酶活性分析
            2.2.8 統(tǒng)計分析
    3 結果
        3.1 敲低PKM抑制了結腸癌細胞的遷移
        3.2 敲低PKM抑制了結腸癌細胞與基質的粘附作用
        3.3 敲低PKM引起結腸癌細胞遷移與粘附變化的分子機制
        3.4 過表達PKM2能促進結腸癌細胞的遷移和粘附
        3.5 過表達PKM2逆轉結腸癌細胞遷移、粘附相關的信號
        3.6 PKM2調控STAT3表達的機制
        3.7 PKM2通過調控STAT3表達來促進DLD1細胞遷移和細胞基質粘附
        3.8 PKM2促進結腸癌細胞遷移和粘附依賴其蛋白激酶活性
    4 討論
第四章 PKM2促進結腸癌細胞炎癥因子分泌及增殖的分子機制
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 細胞
            2.1.2 試劑與抗體
            2.1.3 主要試劑配制方法
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)
            2.2.2 細胞漿蛋白、核蛋白抽提和western blot分析
            2.2.3 MTT法檢測LPS對結腸癌細胞增殖的影響
            2.2.4 qPCR分析
            2.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測TNF-α與IL-1β的分泌
            2.2.6 siRNA轉染敲低STAT3
            2.2.7 免疫質免疫共沉淀（ChIP）分析
            2.2.8 丙酮酸激酶活性分析
            2.2.9 統(tǒng)計分析
    3 結果
        3.1 LPS促進DLD1細胞TNF-α與IL-1β的表達與細胞增殖
        3.2 LPS誘導DLD1細胞中炎癥因子的表達和代謝改變
        3.3 敲低PKM能逆轉LPS引起的結腸癌細胞炎癥因子的表達與增殖
        3.4 PKM2過表達促進LPS誘導的DLD1細胞炎癥因子的表達與增殖
        3.5 NF-κB信號調控LPS誘導的PKM2的表達
        3.6 PKM2通過上調STAT3表達來調控TNF-α和IL-1β的表達
        3.7 ChIP檢測PKM2結合STAT3啟動子
        3.8 LPS同時誘導了胞內(nèi)PKM2的丙酮酸激酶及蛋白激酶活性
        3.9 PKM2誘導的炎癥因子分泌依賴其蛋白激酶活性
    4 討論
第五章 分泌型PKM2對結腸癌細胞遷移的影響及分子機制
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 細胞、菌株與質粒
            2.1.2 試劑與抗體
            2.1.3 主要試劑配制方法
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基的收集
            2.2.2 重組表達質粒pGEX-4T-1-PKM1和pGEX-4T-1-PKM2的構建
            2.2.3 重組蛋白GST-PKM1、GST-PKM2的表達與純化
            2.2.4 細胞劃痕法檢測細胞遷移
            2.2.5 實時定量PCR檢測mRNA變化
            2.2.6 Western blot檢測蛋白變化
            2.2.7 瞬時轉染敲低β-catenin、PKM2
            2.2.8 PI3K信號通路抑制劑LY294002對細胞遷移的影響
            2.2.9 統(tǒng)計學分析
    3 結果
        3.1 結腸癌細胞系中分泌型PKM1、PKM2的檢測
        3.2 重組表達質粒pGEX-4T-1-PKM1和pGEX-4T-1-PKM2的構建
        3.3 重組蛋白GST-PKM1、GST-PKM2的表達與純化
        3.4 分泌型PKM2促進結腸癌DLD1細胞遷移
        3.5 敲低PKM2抑制PKM2的分泌及DLD1細胞的遷移
        3.6 分泌型PKM2活化p-catenin信號通路
        3.7 分泌型PKM2激活PI3K/Akt促進結腸癌細胞遷移
    4 討論
總結與展望
參考文獻
個人簡歷及讀博期間發(fā)表文章
致謝
承諾書


本文編號：2867949