研究背景和目的:乳腺癌(Breast cancer,BC)是世界上導(dǎo)致女性癌癥相關(guān)死亡率的第二大原因,并且超過(guò)90%的病例是死于轉(zhuǎn)移。為了形成轉(zhuǎn)移病變,惡性腫瘤細(xì)胞必須從原位腫瘤脫離,侵入周?chē)拈g質(zhì)組織,進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并存活,最終成為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)。這一過(guò)程又稱(chēng)之為集體侵襲(collective invasion),是臨床靶向治療的重要窗口期,因?yàn)樗梢栽诿黠@臨床癥狀出現(xiàn)前就發(fā)生。BC組織是高度異質(zhì)性的,包含多種細(xì)胞成分�；谵D(zhuǎn)錄組(trascriptome)的分析表明即使是腫瘤細(xì)胞也有不同免疫表型,BC因此可以主要分為3個(gè)亞型:管腔型(激素受體陽(yáng)性)、HER2過(guò)表達(dá)型(HER2陽(yáng)性,激素受體陰性)和三陰型乳腺癌(HER2和激素受體陰性)。值得注意的是,BC的進(jìn)展伴隨著細(xì)胞活動(dòng)能力(motility)和間質(zhì)侵犯力的增強(qiáng)。在臨床病例和動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn),與其他腫瘤細(xì)胞相比,處于侵襲性邊緣或集體侵襲過(guò)程的癌癥細(xì)胞具有不同的免疫表型。大量的研究證實(shí)細(xì)胞角蛋白14(cytokeratin 14,CK14),一種正常乳腺發(fā)育所必須的蛋白質(zhì),可以賦予腫瘤細(xì)胞一種保守的向基底細(xì)胞轉(zhuǎn)變的能力。乳腺胚胎斑中的遷徙細(xì)胞表現(xiàn)為CK14~+CK8~+SMA~-。正常乳腺成體干細(xì)胞和具有顯著侵襲性的癌癥細(xì)胞,而不是相對(duì)比較惰性的癌癥細(xì)胞,可以高表達(dá)CK14。盡管正常導(dǎo)管細(xì)胞不表達(dá)CK14,導(dǎo)管型腫瘤細(xì)胞重新表達(dá)CK14有助于轉(zhuǎn)移的發(fā)生。但其中的分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚。正常發(fā)育過(guò)程中,Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)控包括干細(xì)胞多能性和分化能力等細(xì)胞生物學(xué)行為過(guò)程中具有重要作用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活可以導(dǎo)致乳腺異型增生,其中包含CK14~+CK5~+CK8~-αSMA~-基底樣細(xì)胞,表明CK14的表達(dá)可能受到Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控。然而,另外一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題是這一過(guò)程中,Wnt配體的具體細(xì)胞學(xué)來(lái)源不明。免疫細(xì)胞被認(rèn)為是一種微環(huán)境調(diào)控成員,在BC發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在疾病早期,組織能夠分泌細(xì)胞因子/炎癥因子,比如TGF-β、IFN-γ和TNF-α,來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。而當(dāng)慢性損傷和致癌物持續(xù)存在,這種微妙的平衡將被非可控性炎癥打破,轉(zhuǎn)變成腫瘤發(fā)生過(guò)程中的起始事件。BC細(xì)胞可以通過(guò)mTOR信號(hào)通路或者分泌粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)來(lái)募集髓系來(lái)源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)進(jìn)入腫瘤內(nèi)。MDSCs起源于骨髓和脾臟,可以分為2種主要類(lèi)型:粒細(xì)胞型MDSCs(granulocytic MDSCs,PMN-MDSCs,CD45~+CD11b~+Ly6G~(hi))和單核細(xì)胞型MDSCs(monocytic M-MDSCs,CD45~+CD11b~+Ly6C~(hi))。課題組最近一篇文章表明組氨酸脫羧酶(histamine decarboxylase,Hdc)可以作為骨髓髓系偏向造血干細(xì)胞/前體細(xì)胞(myeloid-biased hematopoietic stem cell/progenitor cell,MB-HSC/HSPC)的標(biāo)記物。在衰老、損傷和腫瘤發(fā)生時(shí),MB-HSC/HSPC可以作為未成熟髓系細(xì)胞的組織學(xué)來(lái)源。表達(dá)Hdc的PMN-MDSCs在動(dòng)物模型中可以通過(guò)募集Foxp3~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來(lái)促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生。在過(guò)去的十年內(nèi),探索基于抑制癌癥相關(guān)MDSCs的個(gè)性化靶向治療策略取得了顯著進(jìn)展。然而,在這些方法可以應(yīng)用于臨床之前,許多備受關(guān)注的爭(zhēng)論尚需得到解決。例如,迄今為止我們對(duì)于促進(jìn)BC進(jìn)展的免疫細(xì)胞的具體身份尚不清楚,其中一個(gè)重要原因也是因?yàn)檫@些細(xì)胞的異質(zhì)性。本研究中,我們通過(guò)臨床病例和動(dòng)物模型觀察了CK14表達(dá)在晚期BC進(jìn)展過(guò)程中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果表明:相比于原位腫瘤,在BC轉(zhuǎn)移灶中Hdc~+PMN-MDSCs數(shù)量顯著增多并且表達(dá)高水平的Wnts來(lái)異常激活臨近癌癥細(xì)胞內(nèi)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路,從而提高CK14的表達(dá)。這些研究結(jié)果進(jìn)一步揭示了Hdc~+PMN-MDSCs和浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制,并且表明通過(guò)抑制或阻斷腫瘤相關(guān)Hdc~+PMN-MDSCs的靶向策略有助于乳腺癌治療。方法:1、搜集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院和第四附屬醫(yī)院的乳腺癌手術(shù)標(biāo)本蠟塊,制作成組織芯片,再通過(guò)常規(guī)染色和免疫組織化學(xué)染色評(píng)估和比較原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位腫瘤細(xì)胞表達(dá)CK14的情況;2、構(gòu)建Hdc-CreER~(T2);eGFP;MMTV-PyVT雌性小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移模型,通過(guò)免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)移組織內(nèi)MDSCs的構(gòu)成和數(shù)量變化;3、通過(guò)免疫組化法觀察轉(zhuǎn)移BC細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)和定位情況,來(lái)初步推斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活情況;4、通過(guò)porcupine~(flox/flox)和iDTR轉(zhuǎn)基因小鼠,阻斷Hdc~+PMN-MDSCs來(lái)源的Wnts合成和分泌或去除所有Hdc~+免疫細(xì)胞,觀察體內(nèi)BC形成和進(jìn)展、BC細(xì)胞表達(dá)CK14和Wnt/β-catenin活化情況。結(jié)果:1、112例未發(fā)生轉(zhuǎn)移的管腔型乳腺癌中只有5例(4.5%)表達(dá)局灶CK14,而117例轉(zhuǎn)移性乳腺癌病例中有33例(28.2%)出現(xiàn)CK14的彌漫強(qiáng)陽(yáng)性。2、在BC轉(zhuǎn)移病例內(nèi)CD15~+PMN-MDSCs的數(shù)量顯著增多,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步表明在轉(zhuǎn)移性BC動(dòng)物模型內(nèi),Hdc~+PMN-MDSCs向腫瘤組織聚集并擴(kuò)增。3、RNA-Seq和RT-PCR結(jié)果表明CK14~+BC組織內(nèi)的Hdc~+PMN-MDSCs高表達(dá)多種Wnts,包括Wnt2,4,5a和7b。4、通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物消除Hdc~+免疫細(xì)胞或其來(lái)源的Wnts可以顯著抑制BC轉(zhuǎn)移的發(fā)生以及CK14的陽(yáng)性率。結(jié)論:綜上所述,我們的研究發(fā)現(xiàn)MDSCs,特別是Hdc~+PMN-MDSCs在轉(zhuǎn)移性BC組織內(nèi)聚集和擴(kuò)增,通過(guò)分泌高水平的Wnts,以類(lèi)似旁分泌的形式異常激活臨近癌細(xì)胞內(nèi)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路,促進(jìn)CK14的表達(dá)和BC的進(jìn)展,為后期基于Hdc~+PMN-MDSCs靶向治療開(kāi)發(fā)提供分子理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類(lèi)】：R737.9
【部分圖文】：

基于前期發(fā)現(xiàn)Hdc+PMN-MDSCs在CK14+腫瘤組織內(nèi)增多,且兩者之間具有密切的空間關(guān)系,所以課題組提出一個(gè)新的假說(shuō),認(rèn)為Hdc+PMN-MDSCs可能是轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中的一個(gè)重要的Wnts細(xì)胞來(lái)源。因此,課題組使用porcupineflox/flox和iDTR小鼠來(lái)去除Hdc+PMN-MDSCs或其來(lái)源的Wnts,進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)假說(shuō)的可能性。一共構(gòu)建三種轉(zhuǎn)基因乳腺癌動(dòng)物模型:1.Hdc-CreERT2;e GFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox用于阻礙Hdc+免疫細(xì)胞分泌Wnts;2.Hdc-CreERT2;e GFP;MMTV-PyMT,DTR用于使用白喉毒素(DT)直接去除所有Hdc+免疫細(xì)胞;3.Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox;DTR轉(zhuǎn)基因小鼠用于同時(shí)消除Hdc+免疫細(xì)胞及其分泌的Wnts(圖1A)。研究結(jié)果表明:與對(duì)照組(Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT)相比,Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox小鼠轉(zhuǎn)移性腫瘤的數(shù)量顯著下降,但腫瘤組織內(nèi)Hdc+PMN-MDSCs的數(shù)量和比例并未見(jiàn)顯著下降(圖1B)。Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT,DTR與Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox小鼠相比,Hdc+PMN-MDSCs的數(shù)量和比例顯著下降,但轉(zhuǎn)移性腫瘤的數(shù)量并無(wú)明顯差別,表明在轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵作用的可能是Hdc+PMN-MDSCs來(lái)源的Wnts。為了進(jìn)一步支持這個(gè)結(jié)論,對(duì)比分析Hdc-CreERT2;e GFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox;DTR轉(zhuǎn)基因小鼠和其他兩組之間的轉(zhuǎn)移情況,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移數(shù)量并無(wú)明顯差距(p>0.05)((圖1B))。綜上所述,這一部分結(jié)果支持在轉(zhuǎn)移性乳腺癌發(fā)展過(guò)程中,Hdc+PMN-MDSCs是微環(huán)境中高水平Wnts的主要來(lái)源之一(圖3)。4.2 Hdc~+PMN-MDSCs來(lái)源的Wnts有助于CK14 的表達(dá)

此前課題組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Hdc+PMN-MDSCs與腫瘤組織CK14的不一致性表達(dá)有密切關(guān)系,且CK14+的病例預(yù)后較差。因此后續(xù)的研究繼續(xù)探討了Hdc+PMN-MDSCs來(lái)源的Wnts在推動(dòng)乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。但異常激活的Wnts/β-catenin是否與CK14的表達(dá)有關(guān)系,尚無(wú)證據(jù)支持。因此,接下來(lái)課題組進(jìn)一步對(duì)比分析了去除Hdc+細(xì)胞或其來(lái)源的Wnts對(duì)腫瘤細(xì)胞表達(dá)CK14的影響。結(jié)果表明與Hdc-CreERT2;e GFP;MMTV-PyMT雌性乳腺癌小鼠相比,porcupineflox/flox、DTR和porcupineflox/flox/DTR三種動(dòng)物模型內(nèi)表達(dá)CK14的比例顯著降低,但三組之間沒(méi)有顯著差別,表明Hdc+PMN-MDSCs來(lái)源的Wnts是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)CK14的主要原因(圖2)。圖3.轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞和Hdc+PMN-MDSCs之間相互作用示意圖。乳腺癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫落,進(jìn)入并在循環(huán)系統(tǒng)存活,最后在遠(yuǎn)隔器官微環(huán)境中增殖。作為腫瘤微環(huán)境中的一個(gè)重要組成成分,Hdc+PMN-MDSCs被募集至轉(zhuǎn)移灶內(nèi)并擴(kuò)增。Hdc+PMN-MDSCs來(lái)源的Wnts以旁分泌樣的方式異常激活癌癥細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號(hào)通路。β-catenin在胞漿和胞核的聚集可以上調(diào)CK14的表達(dá),后者賦予轉(zhuǎn)移細(xì)胞基底樣表型,其特征為具有增強(qiáng)的增殖和抗凋亡能力。因此,浸潤(rùn)的Hdc+PMN-MDSCs對(duì)于轉(zhuǎn)移灶的建立具有重要作用。未來(lái)需要進(jìn)一步闡述轉(zhuǎn)移細(xì)胞和骨髓內(nèi)Hdc+髓系偏向造血干細(xì)胞和前體細(xì)胞之間的相互作用。

圖2.Hdc+PMN-MDSCs來(lái)源的Wnts促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞表達(dá)CK14.與Wnts的水平一致,CK14陽(yáng)性率在porcupineflox/flox、DTR和porcupineflox/flox/DTR轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中顯著降低(p<0.001)。5 結(jié)論
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