背景:人類甲狀腺未分化癌(Anaplastic thyroid carcinoma,ATC)進展快,死亡率高,治療效果較差,其對常用化療藥物阿霉素(Doxorubicin,DOX)耐藥一直是臨床難題。我們前期研究發(fā)現(xiàn),用阿霉素處理ATC細胞株后,存活少量的腫瘤干細胞(Cancer stem cell,CSCs)是ATC細胞發(fā)生耐藥的重要因素。因此,尋找合適的抗甲狀腺腫瘤及腫瘤干細胞的藥物是目前研究的熱點。近年研究證實,穿心蓮內(nèi)酯類化合物對肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等有明顯的抗腫瘤作用,且具有抗多發(fā)性骨髓瘤腫瘤干細胞的效應。然而,穿心蓮內(nèi)酯對ATC的作用暫無相關(guān)報道。納米技術(shù)的發(fā)展為腫瘤的診斷和治療提供了新的方法,我們前期研究也同時發(fā)現(xiàn),多巴胺黑色素納米粒子(Dopamine-melanin nanoparticles,DMNPs)與DOX結(jié)合,可以提高ATC耐藥株HTh74Rdox細胞對DOX的攝取能力,改善耐藥性。而DMNPs對穿心蓮內(nèi)酯的負載能力及結(jié)合后對HTh74Rdox耐藥性的改善作用尚不清楚,值得探索。目的:(1)評估穿心蓮內(nèi)酯在抑制甲狀腺未分化癌細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制細胞遷徙等方面的效果。(2)探討穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合阿霉素化療增敏方面的價值及可能的作用機制。(3)觀察穿心蓮內(nèi)酯對甲狀腺腫瘤干細胞的作用及機制。(4)研究DMNPs對穿心蓮內(nèi)酯的裝載效率,觀察聯(lián)合穿心蓮內(nèi)酯和DMNPs對甲狀腺未分化癌細胞的作用。方法:(1)通過MTT和實時細胞分析觀察穿心蓮內(nèi)酯對甲狀腺未分化癌細胞株HTh74和阿霉素耐藥細胞株HTh74Rdox活性的抑制作用,及穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合阿霉素對HTh74Rdox活性的抑制作用。(2)通過細胞克隆實驗檢測穿心蓮內(nèi)酯對HTh74Rdox細胞增殖的影響。(3)通過Caspase-3活性檢測、流式細胞技術(shù)評價穿心蓮內(nèi)酯對HTh74Rdox細胞凋亡的影響。(4)通過細胞劃痕試驗觀察穿心蓮內(nèi)酯對HTh74Rdox細胞遷徙能力的影響。(5)通過小管形成試驗評估穿心蓮內(nèi)酯對腫瘤血管形成的影響。(6)通過qPCR和Western Blot觀察不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后HTh74Rdox細胞中多藥耐藥通道蛋白MDR1及ABCG2的mRNA和蛋白表達水平。(7)通過qPCR和Western Blot檢測不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后HTh74Rdox細胞中干細胞標志物CD133、Oct-4的mRNA和蛋白表達水平。(8)通過Western Blot檢測不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后HTh74Rdox細胞中MAPK/ERK信號通路中ERK和p-ERK蛋白的表達水平。(9)通過紫外可見分光光度計測定多巴胺黑色素納米粒子對穿心蓮內(nèi)酯的裝載效率。(10)通過MTT檢測聯(lián)合穿心蓮內(nèi)酯和DMNPs對HTh74和HTh74Rdox細胞的活力。結(jié)果:(1)穿心蓮內(nèi)酯對甲狀腺未分化癌HTh74細胞和阿霉素耐藥株HTh74Rdox細胞的活性有抑制作用,穿心蓮內(nèi)酯對HTh74細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為17.2±2.77 μmol/L,而對HTh74Rdox細胞的IC50則為25.9±2.43μmo l/L,并且呈時間和劑量雙重依賴性;穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合阿霉素用藥后阿霉素對HTh74Rdox細胞的IC50為629.6±19.87 ng/ml,阿霉素的耐藥指數(shù)為5.15±0.32,較單藥使用時耐藥性有明顯降低。(2)HTh74Rdox細胞克隆增殖數(shù)量隨穿心蓮內(nèi)酯濃度增加而降低,當穿心蓮內(nèi)酯濃度達到10μmol/L時,HTh74Rdox細胞的克隆增殖水平顯著下降,克隆的有效率為22.3%(P0.01);當穿心蓮內(nèi)酯濃度達到20μmo l/L時,克隆的有效率僅為5%(P0.01)。(3)HTh74Rdox細胞中Caspase-3的活性隨著穿心蓮內(nèi)酯濃度的升高而增高,HTh74Rdox晚期凋亡細胞較對照組明顯增多,當穿心蓮內(nèi)酯的濃度為20μmol/L時,細胞的晚期凋亡率為21.56%。(4)與對照組相比使用不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后的HTh74Rdox細胞遷徙能力明顯下降,當穿心蓮內(nèi)酯濃度達到10μmol/L時,劃痕的開放面積與對照組相比可達126.7%,當穿心蓮內(nèi)酯濃度達到20μmol/L時,劃痕的開放面積與對照組相比可達150.3%,此外還出現(xiàn)了細胞死亡現(xiàn)象。(5)與對照組相比使用不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后HTh74Rdox細胞小管分支數(shù)量無明顯變化。(6)與對照組相比使用不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后HTh74Rdox細胞中多耐藥通道蛋白MDR1及ABCG2的mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P0.05),且成劑量依賴性。(7)與對照組相比使用不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后HTh74Rdox細胞中干細胞標志物CD133、Oct-4的mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P0.05),且成劑量依賴性。(8)與對照組相比不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后HTh74Rdox細胞中p-ERK蛋白的表達水平降低(P0.05),且成劑量依賴性。(9)隨著多巴胺黑色素納米粒子和穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量比的增加,穿心蓮內(nèi)酯的裝載效率均維持在一個較低的水平。(10)聯(lián)合使用穿心蓮內(nèi)酯和DMNPs抑制HTh74和HTh74Rdox的細胞活力,較單獨使用穿心蓮內(nèi)酯對ATC細胞的抑制作用無明顯差異。結(jié)論:(1)穿心蓮內(nèi)酯能抑制HTh74和HTh74Rdox細胞的活性,且對于HTh74Rdox細胞呈藥物劑量和時間依賴性;穿心蓮內(nèi)酯可抑制HTh74Rdox細胞的增殖、遷徙,并增加凋亡作用,但對血管形成無明顯抑制作用。(2)穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合阿霉素作用HTh74Rdox細胞有減藥增效作用,并且可以通過下調(diào)HTh74Rdox細胞MAPK/ERK信號通路中p-ERK蛋白的表達,抑制多耐藥通道蛋白MDR1及ABCG2的mRNA和蛋白表達水平。(3)穿心蓮內(nèi)酯能抑制HTh74Rdox細胞干細胞球的形成,降低干細胞標志物CD133、Oct-4的mRNA和蛋白表達水平。(4)多巴胺黑色素納米粒子對穿心蓮內(nèi)酯的裝載效率較低。聯(lián)合使用多巴胺黑色素納米粒子和穿心蓮內(nèi)酯較單獨使用穿心蓮內(nèi)酯抑制ATC細胞的作用無明顯差異。
【學位單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

南京中醫(yī)藥大學博士學位論文??Ｒｅｃｅｐｔｏｒ?Ｔｙｒｏｓｉｎｅ?Ｋｉｎａｓｅ?（ＲＴＫ）??＼?／?ＶＥＧＦＲ１－３，?ＲＥＴ，?ＦＧＦＲ１－３??ＦｕｓｍｎＲＴＫｓｇｌ?｜｜＾〇３＆３??Ｍｌ—鱗??ｍＢＫＨ?ＢＢＢＢ??ｌｉｌｊｌ??圓■?４？＊－＾３１????ｍ＾ｍ?１?ＭＭｆｌ??Ｇｒｏｗｔｈ，?Ｓｕｒｖｉｖａｌ，?Ｉｎｖａｓｉｏｎ??圖１甲狀腺癌中兩種最常見的遺傳學改變通路：Ｐ１３Ｋ和ＭＡＰＫ??２．１．２?ｐ５３?突變??ｐ５３位于凋亡、侵襲和干細胞相關(guān)基因的大型網(wǎng)絡(luò)的中心。ｐ５３蛋白由核心ＤＮＡ結(jié)??合結(jié)構(gòu)域（ＤＢＤ）和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域共同組成，是抗腫瘤發(fā)生的主要因子。值得注意的是，??ｐ５３突變不僅取消了腫瘤抑制功能，而且，還經(jīng)常導致新的致瘤驅(qū)動活性，這種負面作??用被稱為功能獲得（ＧＯＦ）?［５］。ｐ５３突變體通過諸如轉(zhuǎn)化生長因子Ｐ受體（ＴＧＦ－（３），表??皮生長因子受體（ＥＧＦＲ）和原癌基因ＭＥＴ的受體增強信號傳導。與野生型ｐ５３不同，??突變ｐ５３蛋白已被證實能夠逃避蛋白酶降解，從而導致其在腫瘤中的高度穩(wěn)定［６１。Ｐ５３??的失活也被認為是晚期甲狀腺腫瘤的標志，根據(jù)人類癌癥體細胞突變數(shù)據(jù)庫（ＣＯＳＭＩＣ）??顯示［７］，ＡＴＣ患者中抑癌基因ｐ５３的突變率最高，達到５４％?（圖２）。??９??

第一章理論研究??ａ．；％??５４％??馨??■?４１％??１，??３０％?Ｉ?Ｉ??ｎ＇?＇??漏?ｅ?Ｈ?＾?Ｂ?１２％?１１％??１０％?＿?ｈ’?圖■?＿?＿?８％?Ｍ??ＴＰ５３?了ＳＲＴ?ＢＲＡＦ?ＡＸｉＮｉ?ＮＲＡＳ?ＣＴＮＮ８：ＬＰｎ（３ＣＡ?｝＞Ｔ￡Ｎ?ＮＦ１?ＥＪＦＩＡＸ?ＫＲＡＳ?ｆｖＴＴＯＲ?Ｔ￥ＨＲ?ＣＤＫＮ２Ａ?ＨＲＡＳ?ＡＫＴ１?ＴＳＣ２?Ｃ０ＫＮ２Ｃ?６ＧＦＲ??圖２甲狀腺未分化癌致癌基因突變分布??２．１．３腫瘤干細胞的存在??我們的研究證實，ＡＴＣ細胞株ＳＷ１７３６、Ｃ６４３、ＨＴｈ７４中存在極小比例（０．４１％－０．８３％）??的富含腫瘤干細胞（ＣＳＣｓ）的邊緣細胞群（ＳＰ），這小群細胞表達干細胞標志物０ｃｔ４??和耐藥蛋白ＡＢＣＧ２、ＭＤＲ１等；在阿霉素誘導耐藥的ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ細胞株中，富含腫瘤??千細胞的邊緣細胞群的比例顯著增加至７０％［８］。此后，我們先后比較二甲雙胍與新型抗??腫瘤藥物索拉菲尼對ＡＴＣ細胞株及ＣＳＣｓ的效果，結(jié)果表明，二甲雙胍與索拉菲尼均有??一定的抗腫瘤及ＣＳＣｓ作用。二甲雙胍可通過抑制細胞周期、誘導凋亡等途徑，有效地．??抑制ＡＴＣ細胞的增殖，減少甲狀腺ＣＳＣｓ的克隆形成率，與阿霉素有明顯協(xié)同作用，可??有效降低阿霉素的耐藥，在富含ＣＳＣｓ的耐藥株中上述作用更加明顯［９］。進一步的研究??提示，在二甲雙胍治療的基礎(chǔ)上，索拉菲尼可增強其效果但二甲雙胍、索拉菲尼的??使用劑量己遠超過臨床常規(guī)用量，故尚無實際使用價值。因此，仍需進一步尋找有效的??抗ＡＴＣ及ＣＳＣｓ的藥物。??２．２穿心蓮內(nèi)酯及其類似物的抗腫瘤效應??２．２．１促進癌細胞周期

〇．〇５表示差異有統(tǒng)計學意義。??４實驗結(jié)果??４．１穿心蓮內(nèi)酯抑制ＨＴｈ７４、ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ細胞的活力??４．１．１甲狀腺未分化癌耐藥細胞株ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ具有阿霉素耐藥性??不同濃度的阿霉素（０、１、１０、１００、１０００、ｌ〇〇〇〇ｎｇ／ｍｌ）處理?ＨＴｈ７４、ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ??細胞２４小時，從阿霉素濃度為ｌＯｎｇ／ｍｌ開始，ＨＴｈ７４細胞活力就受到明顯抑制，且呈明??顯的劑量依賴性，而ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ細胞在阿霉素為ｌＯＯＯｎｇ／ｍｌ時細胞活力才開始受到抑制??（圖１）。通過ＧｒａｐｈＰａｄ７軟件計算得出在ＨＴｈ７４細胞中阿霉素的半數(shù)抑制濃度（ＩＣ５０）??為?１２２．５?±６．８９ｎｇ／ｍｌ，而對于?ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ?細胞，阿霉素的?ＩＣ５〇?則高達?２０１１．７士?８５．０１?ｎｇ／ｍｌ，??ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ細胞對阿霉素的耐藥指數(shù)為１６．４５±?１．０８。??１２５ｎ??■?ＨＴｈ７４??＾?１００￣?１?１?Ｏ?ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ??｜７５｜?Ｉ?Ｉ?ｉｌｌ?ｈ??“ｉｌｉｕｍ??Ｄｏｘ（ｎｇ／ｍｌ）?ｏ?１?１０?１００?１０００?１００００??圖１?ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ細胞的阿霉素耐藥性??３５??
【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王深明;葉財盛;;甲狀腺未分化癌治療現(xiàn)狀和展望[J];臨床外科雜志;2006年03期

2 李曉江,于淑珍;甲狀腺未分化癌六例報告[J];河南腫瘤學雜志;2000年05期

3 韓亞騫;劉愛忠;吳湘瑋;王暉;陳杰;曾彪;劉雯;范長根;葉旭;姜翠紅;張韋;;甲狀腺未分化癌治療策略進展[J];腫瘤藥學;2015年04期

4 陳靜;何霞云;;甲狀腺未分化癌的治療進展[J];中國癌癥雜志;2014年04期

5 呂云霞;余濟春;;甲狀腺未分化癌的研究進展[J];實用臨床醫(yī)學;2009年05期

6 李慧靈,潘建基;甲狀腺未分化癌的治療[J];國外醫(yī)學(臨床放射學分冊);1998年05期

7 何霞云;;甲狀腺未分化癌調(diào)強放療聯(lián)合手術(shù)和化療的綜合治療[J];外科理論與實踐;2014年03期

8 何霞云;;甲狀腺未分化癌的綜合治療[J];中國實用外科雜志;2011年05期

9 馬向濤;付靜;余力偉;;甲狀腺破骨細胞樣巨細胞未分化癌1例報告與文獻復習[J];腫瘤防治研究;2007年08期

10 王笑春;甲狀腺未分化癌術(shù)后放療28例療效分析[J];哈爾濱醫(yī)藥;2004年03期

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 陳堃;穿心蓮內(nèi)酯對人甲狀腺未分化癌細胞的生物學特征和阿霉素耐藥的作用研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2020年

2 儲冰峰;下調(diào)NRARP基因?qū)谞钕傥捶只┠[瘤學特性影響的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2016年

3 柳洪宙;老年男性住院患者非甲狀腺性病態(tài)綜合征臨床特征和兩年生存率研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2017年

4 蔡欣妍;新生兒甲狀腺功能的臨床研究[D];中南大學;2014年

5 王琨;碘缺乏與碘過量對甲狀腺功能的影響及其調(diào)控機制的研究[D];天津醫(yī)科大學;2007年

6 丁紅群;積雪草酸及穿心蓮內(nèi)酯靶向線粒體抵御神經(jīng)退行性疾病的作用及相關(guān)機制研究[D];江蘇大學;2019年

7 丁永波;穿心蓮內(nèi)酯對術(shù)后認知功能障礙的影響及相關(guān)機制研究[D];山東大學;2018年

8 桑仲娜;碘過量對不同人群甲狀腺功能影響及成人碘安全攝入量的研究[D];天津醫(yī)科大學;2011年

9 江森;簕菜活性化合物在抗腫瘤聯(lián)合用藥中的作用和機理研究[D];廣東工業(yè)大學;2018年

10 王琦;有機磷、有機氯農(nóng)藥分析方法及甲狀腺內(nèi)分泌干擾效應的研究[D];昆明理工大學;2016年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 周穎;奈韋拉平對甲狀腺未分化癌細胞增殖分化及碘攝取能力的影響[D];山東大學;2012年

2 韓若闊;甲狀腺未分化癌12例臨床分析并文獻復習[D];浙江大學;2009年

3 劉楊;自噬對甲狀腺未分化癌發(fā)病機制及放化療增敏作用的研究[D];吉林大學;2015年

4 鐘兆銘;IL-11促進甲狀腺未分化癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及機制研究[D];昆明醫(yī)科大學;2015年

5 聞曉烽;曲古抑菌素A對甲狀腺未分化癌細胞生長及其端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA表達影響的研究[D];南京醫(yī)科大學;2008年

6 吳驥;紫杉醇對人甲狀腺未分化癌細胞體外作用的實驗研究[D];南京醫(yī)科大學;2007年

7 鄭帥;甲狀腺未分化癌耐藥和轉(zhuǎn)移中腫瘤干細胞和上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用的研究[D];南京醫(yī)科大學;2014年

8 奚級梅;人源甲狀腺未分化癌噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建與篩選[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

9 劉敬敬;甲狀腺未分化癌治療及預后分析[D];天津醫(yī)科大學;2019年

10 王秀華;甲狀腺未分化癌[D];華中科技大學;2019年

本文編號：2860384