第一部分大鼠腎臟足細胞的原代培養(yǎng)目的:通過原代培養(yǎng),獲得生物學特性更穩(wěn)定和更接近于體內的足細胞,為后續(xù)實驗提供基本保證。方法:用高壓蒸汽滅菌的手術器械,從大鼠體內分離腎臟,剝離腎被膜、分離腎臟皮質,然后用剪刀剪碎,分別以大小不同的篩網(wǎng)篩離(75、18目篩網(wǎng)),以DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮篩離的的腎小球,然后接種于培養(yǎng)瓶中(事先將Ⅰ型膠原包被在培養(yǎng)瓶內壁)。通過對大鼠腎臟足細胞特異標志蛋白進行免疫熒光染色(WT-1和Synaptopodin蛋白),對足細胞進行鑒定。結果:從大鼠腎臟分離腎小球后,培養(yǎng)第5天可見細胞克隆從腎小球周圍爬出,這些細胞在形態(tài)學上表現(xiàn)出多邊形等上皮細胞的形態(tài),通過免疫熒光染色,WT-1和Synaptopodin蛋白均呈陽性。結論:以差異過濾法分離腎小球,以WT-1和Synaptopodin作為鑒定足細胞的特異標志蛋白,確認得到原代培養(yǎng)的的大鼠足細胞。第二部分足細胞內PPARγ的表達與定位目的:研究足細胞內PPARγ的表達和定位。方法:分別以RT-PCR和Western blot方法,對大鼠足細胞PPARγm RNA和蛋白水平進行檢測,同時通過免疫組化染色觀察PPARγ在足細胞中的定位。在此基礎上,分別以羅格列酮10μM和吡格列酮1μM處理足細胞24小時,檢測PPARγ在足細胞中的表達變化。為了進一步檢測作為轉錄因子PPARγ的生物學活性,以包含PPRE的熒光素酶報告基因質粒PGL3-PPRE和對照質粒PRL-TK共同轉染足細胞,檢測PPRE的熒光素酶活性。結果:經(jīng)RT-PCR檢測,正常大鼠腎臟足細胞中表達PPARγ。以吡格列酮或羅格列酮分別處理足細胞,可見足細胞內PPARγ蛋白表達增加,與正常對照組相比,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。免疫組化染色顯示PPARγ陽性染色位于細胞質、細胞核和足突。吡格列酮和羅格列酮處理的足細胞,其PPRE熒光素酶活性增強,與對照組相比,有顯著差別(P0.05)。結論:在大鼠腎臟足細胞有PPARγ表達;吡格列酮和羅格列酮誘導PPARγ在足細胞的表達,并增強其PPARγ轉錄活性。第三部分PPARγ激動劑在TGFβ誘導足細胞產生Ⅳ型膠原中的作用的實驗研究目的:通過研究PPARγ激動劑對TGFβ誘導的足細胞Ⅳ型膠原的表達影響,探討PPARγ激動劑在足細胞產生Ⅳ型膠原中的作用。方法:在TGFβ10ng/ml誘導24小時后,分別以羅格列酮10μM和吡格列酮1μM繼續(xù)處理24小時,用ELISA方法檢測各組足細胞培養(yǎng)上清Ⅳ型膠原蛋白的濃度,同時用免疫熒光染色的方法觀察Ⅳ型膠原蛋白的熒光表達強度,之后以Ad-PPARγ-EGFP病毒質粒轉染足細胞或以GW9662處理各組足細胞24小時,收集標本檢測Ⅳ型膠原蛋白在各組中的表達水平。結果:足細胞培養(yǎng)上清Ⅳ型膠原蛋白濃度,在TGFβ組增加明顯,與Control組相比差異顯著(P0.01),而在TGFβ+Rosi組或TGFβ+Pio組則明顯減少,與TGFβ組相比差異顯著(P0.05)。足細胞PPARγ蛋白的表達,與Control組相比,Pio組或Ad-PPARγ組增加,其中Ad-PPARγ組與Ad-vecto組相比增加6倍。Ⅳ型膠原的免疫熒光強度在TGFβ組明顯增強,而TGFβ+Pio組與Control組相比無明顯差別。足細胞內Ⅳ型膠原m RNA和蛋白水平在TGFβ組明顯增加,與Control組相比差異顯著(P0.05),而TGFβ+Rosi組或TGFβ+Pio組則明顯減少,與TGFβ組相比有統(tǒng)計學意義(P0.05)。足細胞內Ⅳ型膠原蛋白表達,在TGFβ+Ad-PPARγ組減少2-3倍,與TGFβ組相比,差異顯著(P0.05),而TGFβ+GW9662組表達明顯增加,且與Control組和TGFβ+Pio組相比,均有明顯差異(P0.05),TGFβ+Pio+GW9662組與Control組相比無明顯差別。結論:TGFβ誘導Ⅳ型膠原在足細胞中的表達;PPARγ激動劑或PPARγ在足細胞的過表達均可抑制Ⅳ型膠原蛋白的產生,而GW9662減弱了這種抑制作用。第四部分PPARγ激動劑抑制TGFβ誘導足細胞Ⅳ型膠原產生的機制研究目的:通過對TGFβ誘導下的P-Smad2/3蛋白表達和Ⅳ型膠原基因SBE熒光素酶活性變化的研究,探討Pio對TGFβ/Smad通路的影響,以及PPARγ激動劑在TGFβ誘導足細胞產生Ⅳ型膠原的機制。方法:以TGFβ10ng/ml誘導足細胞,給予或不給予Pio處理,分別在0、15、30min時用Western blot方法檢測足細胞內P-Smad2/3蛋白表達的變化。以promoter軟件進行啟動子分析,對Ⅳ型膠原基因上的SBE進行預測,然后分別在各處理組細胞對此SBE序列的熒光素酶活性進行檢測。結果:TGFβ誘導足細胞內P-Smad2/3蛋白的表達增加,并隨時間的延長而增加;在每一個時間點,TGFβ+Pio組細胞內P-Smad2/3蛋白表達均減少,與TGFβ組相比,有統(tǒng)計學差異(P0.05);TGFβ誘導下Ⅳ型膠原基因SBE熒光素酶活性增加,而TGFβ+Pio組和TGFβ+Rosi組其活性明顯下降,與TGFβ組相比有統(tǒng)計學意義(P值分別為P0.01和P0.05)。結論:TGFβ可誘導磷酸化Smad2/3的表達,并且是呈現(xiàn)時間依賴性;PPARγ激動劑抑制TGFβ所誘導的P-Smad2/3蛋白在足細胞中的表達;PPARγ激動劑使Ⅳ型膠原基因SBE熒光素酶的活性下降。
【學位單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R692
【文章目錄】：
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前言
第一部分 大鼠腎臟足細胞的原代培養(yǎng)
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 實驗方法
    2 結果
        2.1 腎小球分離
        2.2 腎小球和足細胞的形態(tài)學觀察
        2.3 足細胞標志蛋白的免疫熒光染色
    3 分析與討論
    4 結論
第二部分 足細胞內PPARγ 的表達及定位
    實驗內容
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 實驗方法
    2 結果
        2.1 各組足細胞PPARγ 的表達
        2.2 細胞免疫組織化學染色觀察PPARγ 在足細胞中的表達與定位
        2.3 吡格列酮和羅格列酮對大鼠足細胞內PPRE熒光素酶活性的影響
    3 分析與討論
    4 結論
第三部分 PPARγ 激動劑在TGFβ 誘導足細胞產生Ⅳ型膠原中的作用的實驗研究
    實驗內容
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 實驗方法
    2 結果
        2.1 TGFβ 誘導下，羅格列酮和吡格列酮對足細胞Ⅳ型膠原表達的影響
        2.2 TGFβ 誘導下，Pio或PPARγ 的過表達對足細胞內Ⅳ型膠原表達的影響
        2.3 PPARγ 激動劑Pio和PPARγ 抑制劑GW9662 對TGFβ 誘導的大鼠足細胞Ⅳ型膠原表達的影響
    3 分析與討論
    4 結論
第四部分 PPARγ 激動劑抑制足細胞產生Ⅳ型膠原的機制研究
    實驗內容
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 實驗方法
    2 結果
        2.1 TGFβ 以時間依賴方式上調P-Smad2/3 蛋白的表達及PPARγ 的作用
        2.2 分析預測COL Ⅳ 啟動子上的SBE序列
        2.3 SBE熒光素酶活性的檢測結果
    3 分析與討論
    4 結論
展望
參考文獻
綜述
    參考文獻
致謝
在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果
個人簡歷

【參考文獻】

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1 阮永華,張志剛,張秀榮,劉琛,郭慕依;轉化生長因子β1及其信號轉導分子Smad2在病變腎小球中的表達及其意義[J];中華病理學雜志;2002年04期

本文編號：2844909