肝臟是人體非常獨特的免疫器官,它對于接觸到的大量的食物抗原常常誘導(dǎo)免疫耐受而非免疫應(yīng)答。對這些無害抗原的耐受能使機體減少無謂的免疫反應(yīng),并能保護機體免于對外來抗原的免疫攻擊而導(dǎo)致的肝臟炎癥。然而肝臟免疫耐受的特性是一把雙刃劍,在一些嗜肝病毒如乙型肝炎病毒(HBV),丙型肝炎病毒(HCV)的感染下,肝臟常常不能很好地對其進行清除,使其在肝臟形成慢性感染并伴隨肝臟炎癥,而這是導(dǎo)致肝臟纖維化、肝硬化甚至肝癌的一個重要誘因。因此進一步對肝臟免疫耐受的機制進行研究并研究如何在慢性病毒感染的情況下打破肝臟免疫耐受是非常必要的。CD8+T細胞對于清除HBV是至關(guān)重要的,然而在病毒慢性感染的情況下CD8+T細胞的功能通常處于一種耗竭的狀態(tài),高表達抑制性分子、低表達活化性分子,并且產(chǎn)生抗病毒細胞因子IFN-γ, TNF-α的能力也明顯降低,從而導(dǎo)致其不能很好地發(fā)揮抗病毒的作用,使得病毒在機體中形成持續(xù)感染。多種細胞如調(diào)節(jié)性T細胞、γδT細胞、髓系來源的抑制性細胞(MDSC)被報道可以抑制CD8+T細胞的功能,而清除這些細胞亞群則可以增強CD8+T細胞的抗病毒功能并進而清除HBV。在本研究中我們深入探索了天然免疫的重要分子Toll樣受體2(TLR2)在HBV介導(dǎo)的CD8+T細胞的耗竭中發(fā)揮的作用。在病原體感染及被清除的過程中,會產(chǎn)生對該病原體特異性的記憶性細胞,而記憶性細胞在機體第二次遇到相同病原體的感染時能迅速擴增、發(fā)揮功能進而將該病原體清除。之前的研究一直認為具有記憶功能的細胞主要是獲得性免疫系統(tǒng)的T、B細胞,而NK細胞則被認為是天然免疫的重要組成部分,它能在病原體感染的早期行使其殺傷功能,但一般不認為其具有記憶功能。但最近越來越多的研究表明,NK細胞也具有獲得性免疫細胞的特性并且對于特定的抗原和病原體也有記憶性,同樣能夠保護機體免于相同病原體再次感染時所導(dǎo)致的死亡。因此,我們也關(guān)注在HBV被清除的過程中是否有記憶性NK細胞的產(chǎn)生并且它們是否能夠保護機體免于后續(xù)慢性HBV感染導(dǎo)致的持續(xù)攜帶。我將從以下兩個方面來描述本研究取得的實驗結(jié)果：Ⅰ.TLR2介導(dǎo)HBV持續(xù)攜帶導(dǎo)致的CD8+T細胞的耗竭1.TLR2缺陷促進HBV的排斥我們采用高壓注射低劑量HBV質(zhì)粒的模型來模擬HBV的持續(xù)攜帶,在該模型中,我們發(fā)現(xiàn)TLR2的缺陷能明顯促進小鼠對HBV的排斥,而如果采用TLR2的激動劑使TLR2活化,則小鼠血清中HBV表面抗原的含量明顯增高,表明TLR2活化會導(dǎo)致更為明顯的HBV持續(xù)攜帶。2.TLR2缺陷逆轉(zhuǎn)HBV持續(xù)攜帶導(dǎo)致的CD8+T細胞的耗竭在HBV持續(xù)攜帶的小鼠中,肝臟CD8+T細胞呈現(xiàn)出耗竭的狀態(tài)。而在TLR2-/-HBV-carrier小鼠中,肝臟CD8+T細胞的數(shù)目明顯增多,HBV特異性的CD8+T細胞的比例明顯上升,并且HBV特異性的CD8+T細胞表達PD-1的水平明顯降低,另外,CD8+T細胞表達較多的活化性分子、較低的抑制性分子,產(chǎn)生抗病毒細胞因子IFN-γ,TNF-α的能力也是明顯增強,更為重要的是TLR2-/-HBV-carrier小鼠中功能增強的CD8+T細胞在轉(zhuǎn)輸后能幫助受體鼠抵抗HBV的再次感染,也就證明了TLR2缺陷可以逆轉(zhuǎn)HBV持續(xù)攜帶導(dǎo)致的CD8+T細胞功能的耗竭。3.枯否細胞通過TLR2依賴的方式誘導(dǎo)CD8+T細胞的耗竭進一步我們發(fā)現(xiàn),HBV的注射可以明顯上調(diào)枯否細胞表面TLR2的表達。并且與TLR2缺陷類似,枯否細胞的清除能夠明顯促進野生型小鼠對于HBV的排斥,而如果對野生型小鼠和TLR2-/-小鼠均進行枯否細胞的清除,可以發(fā)現(xiàn)原來存在于兩組小鼠間的對HBV排斥能力的差異就消失了,提示我們表達在枯否細胞表面的TLR2在維持HBV持續(xù)攜帶的過程中發(fā)揮重要作用。另外,與在TLR2-/-HBV-carrier小鼠中觀察到的現(xiàn)象類似,枯否細胞清除的HBV-carrier小鼠肝臟CD8+T細胞的功能也是明顯增強的。因此,枯否細胞可以通過TLR2依賴的方式誘導(dǎo)HBV的持續(xù)攜帶和CD8+T細胞功能的耗竭。4.HBV核心抗原(HBcAg)反應(yīng)性的枯否細胞產(chǎn)生的白細胞介素10(IL-10)促進CD8+T細胞的耗竭HBV質(zhì)粒的注射可以使得枯否細胞向一種更具抑制性的狀態(tài)轉(zhuǎn)變,而且這種轉(zhuǎn)變是依賴TLR2的�？莘窦毎梢酝ㄟ^其表達的TLR2與HBV核心抗原相互作用產(chǎn)生更多的抑制性細胞因子IL-10,而IL-10可以直接抑制CD8+T細胞的功能。在IL-10-/-HBV-carrier小鼠中,CD8+T細胞的功能得到增強,另外HBV特異性的CD8+T細胞的比例在IL-10-/-HBV-carrier小鼠中明顯上調(diào)。并且HBV-carrier小鼠中枯否細胞產(chǎn)生的IL-10可以直接抑制CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ的能力。因此,我們的結(jié)果就表明枯否細胞可以通過TLR2與HBV核心抗原的相互作用分泌更多的IL-10,進而抑制CD8+T細胞的功能。結(jié)論I：在HBV-carrier小鼠中,枯否細胞TLR2表達上調(diào),并且在與HBV核心抗原相互作用后促進枯否細胞產(chǎn)生IL-10,而IL-10可以抑制CD8+T細胞的功能,導(dǎo)致HBV的持續(xù)攜帶。Ⅱ.HBV清除模型中記憶性NK細胞的研究1.HBV被清除的過程中NK細胞得到活化我們采用高壓注射高劑量HBV質(zhì)粒的模型來模擬HBV的清除,發(fā)現(xiàn)在質(zhì)粒注射后NK細胞的比例無明顯變化,但其活化水平增強。2.HBV質(zhì)粒的注射促進NK細胞的增殖和記憶性分子的表達我們發(fā)現(xiàn)HBV質(zhì)粒注射后可以明顯促進使得NK細胞先發(fā)生明顯的增殖,而后增殖能力逐漸降低、恢復(fù)到原有水平。并且在HBV質(zhì)粒注射后,NK細胞表面記憶性分子KLRG1的表達也是先明顯的上調(diào)而后恢復(fù)到原有水平,與之前報道的記憶性NK細胞的表型一致。3.轉(zhuǎn)輸HBV質(zhì)粒致敏的淋巴細胞能保護受體鼠免于低劑量HBV質(zhì)粒注射導(dǎo)致的HBV持續(xù)攜帶我們給受體小鼠轉(zhuǎn)輸來自于高壓注射高劑量HBV質(zhì)粒小鼠的淋巴細胞后再對其進行高壓注射低劑量HBV質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)輸?shù)募毎軒椭荏w小鼠排斥HBV質(zhì)粒。4.轉(zhuǎn)輸HBV質(zhì)粒致敏的NK細胞不能保護受體鼠免于低劑量HBV質(zhì)粒注射導(dǎo)致的HBV持續(xù)攜帶我們給受體小鼠轉(zhuǎn)輸來自于高壓注射高劑量HBV質(zhì)粒小鼠的NK細胞后再對其進行高壓注射低劑量HBV質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)輸?shù)募毎荒軒椭荏w小鼠排斥HBV質(zhì)粒。結(jié)論Ⅱ：在HBV被清除的小鼠中存在記憶樣的NK細胞,但將其轉(zhuǎn)輸后不能促進受體小鼠對于低劑量HBV質(zhì)粒的排斥。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R392

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本文編號：2809130