【摘要】：第一章 小鼠脂肪干細(xì)胞生物學(xué)特性研究背景：干細(xì)胞研究在世界范圍內(nèi)掀起了一股熱潮,因干細(xì)胞具有增殖與分化的特性,所以受到越來越多研究者的關(guān)注。在諸多成體干細(xì)胞的研究中,脂肪干細(xì)胞由于其獨(dú)特的優(yōu)勢,在組織工程學(xué)領(lǐng)域逐漸突顯出來。目的：通過體外分離培養(yǎng)獲得小鼠脂肪干細(xì)胞系,了解其生物學(xué)特性,并為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)材料。方法：以15只成年昆明系小鼠腹部皮下及腹股溝處脂肪組織為材料,Ⅰ型膠原酶37℃條件下消化1h獲得脂肪干細(xì)胞。篩選培養(yǎng)體系對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),應(yīng)用免疫組化鑒定小鼠脂肪干細(xì)胞表面標(biāo)志物,分析小鼠脂肪干細(xì)胞體外擴(kuò)增情況,分析脂肪干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)的染色體核型變化。結(jié)果：15只成年昆明系小鼠,分離獲得12個(gè)小鼠脂肪干細(xì)胞珠,原代細(xì)胞開始培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞短小,呈圓形或卵圓形,胞體折光度高,24小時(shí)后可見培養(yǎng)板有少量細(xì)胞貼壁,48小時(shí)后貼壁細(xì)胞數(shù)量大大增多,待長滿培養(yǎng)板趨于融合時(shí),細(xì)胞變得細(xì)長呈紡錘形,形態(tài)為長梭形。經(jīng)過120天的培養(yǎng)并對細(xì)胞生長情況進(jìn)行記錄,發(fā)現(xiàn)小鼠脂肪干細(xì)胞的生長曲線呈典型的“S”型,PDT分別為42.14hr,46.32hr和43.34hr。細(xì)胞增殖過程經(jīng)歷了潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期,說明小鼠脂肪干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新能力,易于進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)。在體外長期培養(yǎng)時(shí),小鼠脂肪干細(xì)胞的衰老水平很低,在25代以內(nèi)基本沒有明顯衰老現(xiàn)象；在傳至30代時(shí),只有不到5%的細(xì)胞表現(xiàn)出衰老現(xiàn)象,傳至35代時(shí)也僅有不到15%的細(xì)胞表現(xiàn)出衰老現(xiàn)象。脂肪干細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定：顯示CD13, CD29, CD44, CD71, CD73, CD90, CD105和CD166呈陽性表達(dá),MAP-2, GFAP和Nestin呈陰性表達(dá)。MAP-2, GFAP和Nestin為神經(jīng)相關(guān)細(xì)胞標(biāo)志物,說明脂肪干細(xì)胞不表達(dá)神經(jīng)樣細(xì)胞相關(guān)蛋白。小鼠脂肪干細(xì)胞二倍體染色體數(shù)目為2n=40,包括19對常染色體和1對性染色體,性染色體為X,Y。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)所分離的小鼠脂肪干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下擴(kuò)增能力強(qiáng),傳代后細(xì)胞增殖速度快,細(xì)胞形態(tài)良好,衰老水平很低,且未見向神經(jīng)系統(tǒng)分化,為后期神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)和脊髓損傷修復(fù)提供了寶貴實(shí)驗(yàn)材料。第二章 小鼠脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的研究背景：之前相關(guān)的研究認(rèn)為,神經(jīng)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生后,很短的時(shí)間內(nèi)就不會在產(chǎn)生新的神經(jīng)細(xì)胞。這說明成年動物大腦和脊髓內(nèi)部的神經(jīng)細(xì)胞是呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢,這些神經(jīng)細(xì)胞不能夠進(jìn)行再生和自我更新甚至不能夠替代。后天出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷,例如大腦損傷和脊髓損傷,神經(jīng)系統(tǒng)就不能進(jìn)行自我替代修復(fù)。干細(xì)胞來源的神經(jīng)細(xì)胞作為新的神經(jīng)細(xì)胞供體,為神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)帶來新的曙光。目的：通過體外誘導(dǎo)小鼠脂肪干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,為脊髓損傷細(xì)胞治療提供種子細(xì)胞。方法：取第3代培養(yǎng)的小鼠脂肪干細(xì)胞,按5×105/mL細(xì)胞濃度接種于25 cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中。加入含有20 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF和2% B27的培養(yǎng)基,放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。每隔3天,進(jìn)行半量更換培養(yǎng)液。于第5-7天時(shí)就可以看見有類神經(jīng)樣細(xì)胞出現(xiàn),此時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色和RT-PCR鑒定分析nestin。之后對細(xì)胞進(jìn)行吹散、離心,于僅含有2% B27的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。誘導(dǎo)分化完成后,進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色及PCR鑒定。結(jié)果：小鼠脂肪干細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)第3-4天,細(xì)胞開始向中央聚集,第5-7天可見細(xì)胞出現(xiàn)許多小突觸,細(xì)胞開始拉絲能并明顯能區(qū)分出胞體和突起,免疫熒光染色和RT-PCR分析nestin陽性。于僅含有2% B27的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)第10天開始,部分呈現(xiàn)典型的神經(jīng)元樣改變,細(xì)胞呈圓形,內(nèi)可見明顯的細(xì)胞核,細(xì)胞伸出細(xì)長的突起或網(wǎng)狀突起。免疫熒光染色和RT-PCR分析可見細(xì)胞可以表達(dá)MAP-2和GFAPo細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)至第14天時(shí)直徑可達(dá)100um。結(jié)論：在特定的環(huán)境和條件下,小鼠脂肪干細(xì)胞可首先分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,在進(jìn)一步誘導(dǎo)培養(yǎng)后,可分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。第三章脂肪干細(xì)胞治療脊髓損傷及療效評價(jià)背景：近年來,各種來源的干細(xì)胞已被廣泛用于腦、脊髓、周圍神經(jīng)損傷和其他疾病的治療研究。目前使用干細(xì)胞治療主要問題在于細(xì)胞來源,倫理、道德、法律的相關(guān)問題,腫瘤的發(fā)生、神經(jīng)性疼痛和免疫排斥反應(yīng)等不良反應(yīng)。自體來源的脂肪干細(xì)胞因其獨(dú)特的優(yōu)勢,越來越受到人們的關(guān)注。本研究通過使用自體脂肪組織分離的脂肪干細(xì)胞定向向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化,并將誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)細(xì)胞注射移植到脊髓損傷小鼠模型內(nèi),以期使用自體細(xì)胞移植治療脊髓損傷,為干細(xì)胞治療提供新的理論依據(jù)。目的：通過人為制作小鼠脊髓損傷模型,將前期誘導(dǎo)分化好的神經(jīng)細(xì)胞注射移植到損傷模型內(nèi),驗(yàn)證小鼠脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷的能力。方法：首先建立小鼠急性脊髓損傷模型。小鼠用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉。取俯臥位,定位T10節(jié)段,將自制塑料墊片((3mm×3mm)置于T10段脊髓硬脊膜。采用改良Allen's打擊器,完成一次5g×5cm垂直打擊,小鼠尾部痙攣性擺動,雙下肢及軀體回縮撲動,示造模成功。其次進(jìn)行ADSCs的標(biāo)記。取生長狀態(tài)良好的ADSCs,加入上述中的誘導(dǎo)液,觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)生神經(jīng)樣細(xì)胞變化后,利用脂質(zhì)體包裹攜帶有GFP報(bào)告基因的質(zhì)轉(zhuǎn)染到誘導(dǎo)后的細(xì)胞中。第三ADSCs的移植。脊髓損傷后9d時(shí)進(jìn)行細(xì)胞移植治療。麻醉成功后沿原入路切開各層組織,顯露相應(yīng)損傷脊髓節(jié)段,以脊髓損傷區(qū)域?yàn)橹行?實(shí)驗(yàn)組用微量注射器移植10μl細(xì)胞懸液(1.0×105 cells/μl), PBS對照組注射同體積的PBS,模型對照組不做任何處置。移植完畢后逐層關(guān)閉切口。術(shù)后常規(guī)護(hù)理,從移植前1d至結(jié)束全程給予環(huán)孢霉素A(10 mg/kg/d)注射。移植術(shù)后4周時(shí)用4%多聚甲醛行心臟灌注固定小鼠,取損傷脊髓節(jié)段制作冰凍切片進(jìn)行檢測。結(jié)果：4周后對實(shí)驗(yàn)組和PBS對照組進(jìn)行免疫組化檢測,實(shí)驗(yàn)組的大鼠細(xì)胞能夠聚集填充脊髓損傷區(qū)域,動物脊髓內(nèi)的神經(jīng)纖維發(fā)生再生,這些神經(jīng)纖維形成網(wǎng)狀與移植的干細(xì)胞在脊髓組織內(nèi)形成交織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),將脊髓損傷處的兩端進(jìn)行連接。PBS對照組沒有出現(xiàn)大量的GFP陽性細(xì)胞,脊髓的損傷部位具有較大的空洞,這些空洞呈現(xiàn)囊性。對動物的行為學(xué)進(jìn)行觀察可知,實(shí)驗(yàn)組動物的后肢運(yùn)動能力和功能恢復(fù)顯著好于其他兩組。對其進(jìn)行BBB評分結(jié)果可見,實(shí)驗(yàn)組小鼠BBB的評分結(jié)果顯著高于其他兩組的動物評分。SPSS對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知,實(shí)驗(yàn)組動物干細(xì)胞移植后的不同時(shí)期與PBS對照和模型對照組比較都具有顯著差異,且這些差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：將小鼠脂肪干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞移植于脊髓損傷處,能在動物的脊髓損傷部位存活生長,甚至對周圍組織能夠重建神經(jīng)環(huán)路,最后對機(jī)體功能進(jìn)行重建和完善。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2
【圖文】：

呈圓形或卵圓形，胞體折光度高，２４小時(shí)后可見培養(yǎng)板有少量細(xì)逡逑胞貼壁，４８小時(shí)后貼壁細(xì)胞數(shù)量大大增多，待長滿培養(yǎng)板趨于融合時(shí)，細(xì)胞變逡逑得細(xì)長呈紡錐形，形態(tài)為長梭形（圖２－１）。經(jīng)過１２０天的培養(yǎng)并對細(xì)胞生長情況逡逑進(jìn)行記錄，發(fā)現(xiàn)小鼠ＡＤＳＣｓ的生長曲線呈典型的＂Ｓ＂型。從圖２－２中可Ｗ看出，逡逑不同代次的ＡＤＳＣｓ的生長曲線均呈典型的＾＂形，ＰＤＴ分別為４２．１４ｈｒ，４６．３２ｈｒ逡逑和４３．３４ｈｒ。細(xì)胞增殖過程經(jīng)歷了潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期，說明ＡＤＳＣｓ逡逑具有較強(qiáng)的自我更新能力，易于進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)。說明我們分離的小鼠逡逑ＡＤＳＣｓ具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性，符合體外長期培養(yǎng)及后期的研究工作。逡逑W逡逑圖２－１體外培養(yǎng)的ＡＤＳＣｓ逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＡＤＳＣｓ逡逑２５逡逑

博壬學(xué)位論文邐逡逑１．３．３鼠ＡＤＳＣｓ核型分析逡逑鼠ＡＤＳＣｓ二倍體染色體數(shù)目為２ｎ＝４０，包括１９對常染色體和１對性染逡逑色體，性染色體為義Ｙ，雄性為異配ＸＹ，雌性為同配ＸＸ，，染色體大小順逡逑序及特征見圖２－４。這與報(bào)道的鼠染色體研究結(jié)果基本一致。逡逑

則沒有送兩種基因的表達(dá)。Ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ結(jié)果分析可知（如圖３－３），隨著誘導(dǎo)逡逑時(shí)間的延長，神經(jīng)樣細(xì)胞標(biāo)志物也隨之X椉櫻得鞅臼笛櫚撓盞繼跫吞逑凳清義匣竦昧順醪降某曬Αｅ義希牽疲粒繡危危澹螅簦椋鑠危停澹潁紓澹溴義襄義

本文編號：2801229