【摘要】：前言近年來,隨著外科學迅速的發(fā)展,全身麻醉的比例逐漸增高,它能夠保證不同種類的手術(shù)能夠得到無痛以及較為安全舒適的操作條件。雖然全身麻醉已經(jīng)經(jīng)歷了接近兩個世紀,但其具體作用機理仍然無明確的解釋。隨著外科手術(shù)量的增加,術(shù)后認知功能障礙等一些相關(guān)麻醉并發(fā)癥逐年增加,有關(guān)麻醉藥物對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用成為大家關(guān)注的焦點問題,尤其是全身麻醉藥物是否會影響嬰幼兒、兒童將來學習以及記憶功能這一問題得到了全球麻醉及外科醫(yī)生的普遍關(guān)注。七氟醚因其誘導及蘇醒快,對肝腎功能以及血流動力學影響小等優(yōu)點,目前在臨床上應用較廣泛。有研究認為,七氟醚可能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應,還能引發(fā)氧化應激以及細胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)失衡,進而對大鼠的認知功能產(chǎn)生影響。動物實驗研究表明,無論是靜脈藥物還是吸入藥物都能引發(fā)中樞神經(jīng)細胞的凋亡,尤其是在大腦組織發(fā)育的關(guān)鍵階段,麻醉藥物對中樞神經(jīng)網(wǎng)絡構(gòu)建產(chǎn)生影響,使今后的學習以及記憶功能受到損害。動物研究發(fā)現(xiàn),異氟醚除了能增加中樞神經(jīng)細胞凋亡,還能夠抑制祖細胞增殖,因而可降低新生動物今后的學習及記憶能力。有一項最近的研究發(fā)現(xiàn),早期的麻醉能夠增加兒童患學習障礙的風險。另外一項研究表明小于兩歲的與大于兩歲的兒童相比,麻醉后患有成年后行為異常的風險增加。這些研究暗示了麻醉神經(jīng)毒性作用可能是兒童發(fā)展為學習障礙和成年后行為異常的危險因素。有臨床前期實驗闡述了七氟醚全麻對于發(fā)育中大腦的神經(jīng)毒性作用與神經(jīng)元凋亡和隨之的認知功能障礙相關(guān)。因此,能夠?qū)股窠?jīng)元凋亡的治療方法可能減輕七氟醚誘導的神經(jīng)認知功能損害。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,鞘磷脂尤其是神經(jīng)鞘磷脂是少突膠質(zhì)細胞和髓鞘的基本組成成分。神經(jīng)鞘磷脂可以被酶催化形成神經(jīng)酰胺,后者可以被神經(jīng)酰胺酶進一步催化形成鞘氨醇,鞘氨醇可以被鞘氨醇激酶(sphingosine kinases, SphK)磷酸化而形成1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)。SIP的信號傳輸路徑能夠刺激神經(jīng)元的生長和存活。有報道稱S1P能促進PC12細胞和人工培養(yǎng)的腦神經(jīng)元存活。細胞內(nèi)S1P水平增加可以抑制PC12細胞由于外源性神經(jīng)氨酸的添加或者漿液缺乏導致的凋亡。而且,最近的一項研究表明,鞘氨酸激酶1/S1P信號傳遞的缺乏能夠破壞神經(jīng)元細胞的生長和存活,并破壞神經(jīng)祖細胞在感覺神經(jīng)節(jié)的發(fā)育過程。FTY720是一種較為新型的免疫抑制劑,它是從冬蟲夏草的培養(yǎng)液中提取出具備免疫抑制作用的成分,再進行結(jié)構(gòu)改造而成。它的免疫抑制作用不同于傳統(tǒng)的淋巴細胞激活信號機制,而主要是通過對淋巴細胞定居和遷徙發(fā)揮作用。FTY720是磷酸鞘氨酸(S1P)受體激動劑,最近報道它能夠提高大鼠或大鼠模型腦缺血、腦出血以及缺血性卒中、急性脊髓損傷的神經(jīng)產(chǎn)物,進而顯著促進神經(jīng)功能的恢復。我們本研究的目的是FTY720所產(chǎn)生的神經(jīng)保護效應是否能夠?qū)蛊叻岩l(fā)的神經(jīng)毒性。研究方法1.動物實驗所有的實驗程序都獲得山東省立醫(yī)院動物常務委員會批準,120只7天齡SD大鼠從中國醫(yī)學科學研究院獲得,動物可以自由飲水進食,并提供12小時晝夜循環(huán)。2.初級海馬神經(jīng)元的準備海馬神經(jīng)元是由18天大鼠制取,海馬組織從頭部解剖,神經(jīng)元通過胰蛋白酶和研磨來分離。神經(jīng)元被保存在37。C含5%CO2和95%空氣潮濕環(huán)境的無血漿B27母細胞介質(zhì)中。神經(jīng)元是經(jīng)體外實驗培養(yǎng)7天采用抗-MAP抗體提純。3.麻醉暴露神經(jīng)元在4×105/ml密度的六孔盤中培養(yǎng)。大鼠幼崽在一個37。C的密閉空間內(nèi)接觸七氟醚,七氟醚由一個固定口徑的噴霧器向空間內(nèi)傳送。接觸氣體包括七氟醚混合了3%的C02、21%的02和平衡N2�；铙w實驗是采用出生后7天的大鼠幼崽。隨機分成5組(n=24每組)。對照組暴露在5%C0221%02和平衡N2混合氣體中6小時.其他四組的所有大鼠注射溶劑(DMSO)、FTY720 (1mg/Kg), FTY720和MEK抑制劑(U0126 10mg/Kg),或者FTY720和VPC20319 (0.5mg/Kg)。均暴露于2.1%的七氟醚5%C0221%02和平衡N2混合氣體中6小時。我們選擇2.1%的七氟醚濃度是與臨床相關(guān)的大鼠不能致死的濃度。氣體以2L/min速度吹入大鼠的環(huán)境中。七氟醚暴露后,每組中12只大鼠立即被實施安樂死,采集海馬組織做免疫印跡分析。其他大鼠繼續(xù)生長至35天用作神經(jīng)認知評估。4.免疫印跡分析正如前面描述的海馬組織和神經(jīng)元培養(yǎng)為免疫印跡做準備。神經(jīng)元培養(yǎng)和海馬組織的溶解產(chǎn)物以12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺瓊脂電泳分離,然后進行PVDF轉(zhuǎn)膜。初級抗體為抗ERKl/2抗體以及抗Bax抗體和抗Bcl-2抗體,隨后用辣根過氧化酶標記的二級抗體孵育并顯色分析。5.細胞凋亡分析細胞凋亡的檢測采用FITC標記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)凋亡試劑盒進行。細胞用冰的磷酸鹽緩沖劑洗脫,然后以1×106cell/ml的濃度以緩沖液混懸。細胞采用膜聯(lián)蛋白v-FITC和Propidium iodide在黑暗環(huán)境中染色15分鐘后以流式細胞儀分析。Annexin V-FITC陽性且Propidium iodide陰性的細胞被認為是凋亡細胞。6.神經(jīng)損傷的評估曠場試驗是用來評估一般運動活動、探索習慣和前面提到的焦慮。大鼠幼崽被暴露于七氟醚中,然后置于曠場中,觀察大鼠在一定時間內(nèi)所通過區(qū)域數(shù)值。物體識別實驗是用兩組新事物識別任務來評估,大鼠幼崽在接觸七氟醚之前,先在盒子中用兩個識別物體來預檢測建立基線。七氟醚暴露后,將大鼠幼崽放在盒子里,允許它們探索兩個放置在一定距離的識別物體三分鐘。它們被移入盒子兩小時后將其中一個熟悉的物體換成不同形狀和外觀再重新測試。探索所有物體的時間被記錄。數(shù)據(jù)用大鼠幼崽探索新物體與熟悉物體時間百分比來表示。研究結(jié)果].七氟醚是以一種時間依賴性方式誘發(fā)神經(jīng)元凋亡。神經(jīng)元凋亡在七氟醚暴露3,6,9小時后采用流式細胞儀評估。與對照組相比神經(jīng)元凋亡隨時間增長。神經(jīng)元凋亡數(shù)分別是11.4±0.5%,24.9±1.9%,28.2±2.3%。相反,對照組暴露于混合氣體組9小時后凋亡率無明顯變化。2.FTY720減輕體外實驗七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡。為了闡述FTY720對于七氟醚誘發(fā)神經(jīng)元凋亡的保護效應,細胞在暴露七氟醚時用不同濃度的FTY720培養(yǎng)。之前的研究表明超生理微摩爾濃度的FTY720致大鼠小腦神經(jīng)元凋亡。此外,一項早期臨床前期動物模型研究報道0.14μM濃度的FTY720才具有治療作用。因此,在我們的實驗中,我們檢測5-10nM的FTY720對神經(jīng)元的凋亡效應。結(jié)果表明,10nM濃度的FTY720能有效保護神經(jīng)元對抗七氟醚的促凋亡作用。(17.2±1.3%,P0.05,七氟醚暴露6小時)。應用FTY720 50和100nM濃度,凋亡細胞降低到8.9±1.1%和6.1±0.7%。3.FTY720激活的S1P受體能夠預防體外實驗七氟醚誘導的神經(jīng)細胞凋亡當FTY720被2型SPHK轉(zhuǎn)化成磷酸鹽時,在毫微摩爾濃度下,便具備了S1P1、S1P3、S1P4、S1P5的全激動劑功能。為了驗證這一假設(shè)FTY720主要擔當神經(jīng)元中S1P1激動劑的這一假設(shè),我們檢測了選擇性S1P1激動劑SEW2871和S1P1拮抗劑VPC23019對于七氟醚誘導的神經(jīng)細胞凋亡作用,0.5μM的SEW2871與50nnM的FTY720具有相似的神經(jīng)保護作用。反之,0.5μM的VPC23019能夠消除FTY720的神經(jīng)保護作用�？傊�,這些結(jié)果表明FTY720對于S1Pl的激活能夠阻礙七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)凋亡。4.FTY720通過使ERKl/2磷酸化來防止神經(jīng)元凋亡新的證據(jù)表明通過S1P1受體的存活信號與ERK1相關(guān)。因此,我們測試FTY720是否能夠通過激活ERK1/2發(fā)揮抗凋亡作用。當培養(yǎng)的神經(jīng)元暴露于七氟醚中時,暴露組與對照組相比磷酸化的ERK1/2顯著降低,然而,FTY720組的磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)水平能夠顯著維持。此外,VPC23019處理能夠消除暴露于七氟醚下的FTY720對于p-ERK1/2水平的維持作用,表明FTY720通過結(jié)合S1P1受體來激活ERK1/2信號傳導。為了進一步明確ERK1/2在FTY720神經(jīng)保護中的作用,在神經(jīng)元暴露于七氟醚時用FTY720和MEK抑制劑(U0126,5μM)處理,FTY720的抗凋亡作用被U0126消除,這些數(shù)據(jù)表明,FTY720通過S1P1依賴的ERK1/2路徑激活來保護神經(jīng)元對抗七氟醚誘導的凋亡。5.FTY720通過調(diào)節(jié)Bcl2/Bax比例來減弱七氟醚誘導的神經(jīng)毒性。麻醉劑誘導的神經(jīng)元凋亡對麻醉劑神經(jīng)毒性其重要作用。為了檢驗Bcl-2/Bax比例的調(diào)節(jié)是否是FTY720對抗七氟醚誘發(fā)神經(jīng)凋亡的基礎(chǔ),我們檢測Bcl-2,Bax細胞凋亡蛋白的水平。我們的結(jié)果表明七氟醚暴露能明顯降低Bcl-2/Bax比例,導致斷裂細胞凋亡蛋白酶-3水平升高。相反,FTY720升高和Bel-2/Bax比例的降低,能夠使七氟醚處理過的神經(jīng)元中的斷裂細胞凋亡蛋白酶-3減少。此外,我們發(fā)現(xiàn),加入VPC23019或U0125能夠逆轉(zhuǎn)FTY720對于暴露七氟醚的神經(jīng)元的調(diào)節(jié)效應�？偠灾�,FTY720通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例來防止七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)凋亡。Bcl-2/Bax比例調(diào)節(jié)是通過S1P1依賴的ERKl/2激活來完成。6.FTY720能夠減輕七氟醚暴露引起的神經(jīng)損傷FTY720的神經(jīng)保護作用采用大鼠幼崽做測試,有報道稱給予大鼠0.1 ～1mg/kg的FTY720時,血漿濃度低于1ng/ml,給予1mg/kg是安全的。因此,大鼠幼患在暴露七氟醚之前注射媒介物(DMSO)或1mg/kgFTY720, FTY720和MEK抑制劑(U0126,1mg/kg)或FTY720和VPC23019 (0.5mg/kg)。盡管七氟醚加媒介組大鼠活動距離輕微降低,但與其他組比無顯著差異,表明大鼠沒有情緒抑制及運動功能障礙,反之,應用兩個物體間的識別任務實驗來測試學習和識別記憶。七氟醚加媒介組的大鼠幼崽在探索新物體時花費了更多的時間,然而七氟醚加FTY720組與對照組花費時間相似,表明FTY720可以降低七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)認知損傷。我們同時觀察到共同應用U0126和VPC23019能夠消除FTY720對于七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)毒性的神經(jīng)保護作用。7.FTY720通過抑制七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡來提高神經(jīng)產(chǎn)物。為了進一步明確FTY720通過防止神經(jīng)元凋亡來保護大鼠幼崽對抗七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)毒性,我們采用免疫印跡分析法檢測凋亡分子與體外試驗相似,注射了FTY720的大鼠神經(jīng)元凋亡數(shù)少于只注射媒介組。由斷裂細胞凋亡蛋白酶-3水平的降低可以證明,此外,向大鼠體內(nèi)注射FTY720的同時注射U0126或VPC23019,斷裂細胞凋亡蛋白酶-3水平升高,出現(xiàn)了與活體實驗一致的神經(jīng)保護作用。在活體內(nèi)FTY720對于Bcl-2, Bax和ERK1/2的調(diào)節(jié)效應也被檢測到,表明了在活體內(nèi)FTY720通過SlP1依賴的ERK1/2信號傳導路激活來調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例。研究結(jié)論通過我們的研究,可以與既往的研究相互印證,證實七氟醚可以誘導神經(jīng)元凋亡,并可以導致大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的損傷,導致認知與學習能力的降低,但是對于深層次的情緒方面如焦慮并沒有明顯影響。FTY720對七氟醚導致的神經(jīng)元凋亡以及大鼠神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)的損傷具有保護作用,可以消除七氟醚所誘導的凋亡以及減輕七氟醚導致的大鼠認知能力降低。通過對S1P傳導通路進一步細化的研究表明,FTY720的這種保護作用是通過作為S1P受體激動劑而作用于S1P信號傳導通路來起作用,具體作用位點應當作用于ERK1/2磷酸化和調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例來防止神經(jīng)元凋亡、減輕神經(jīng)系統(tǒng)毒性。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R614

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本文編號：2795591