發(fā)布時(shí)間：2020-08-04 09:33

【摘要】：背景:先天性心臟病(Congenital Heart Disease,CHD)是由于胎兒的心臟在母體內(nèi)發(fā)育缺陷或部分發(fā)育停頓所造成的畸形,簡稱先心病,發(fā)病率0.8-1%,是目前最常見的出生缺陷,而且也一直是引起嬰幼兒死亡的首要原因。我國每年新增CHD嬰兒約16-20萬,CHD不僅可導(dǎo)致胎兒生長發(fā)育遲緩,而且常導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎等。如果CHD得不到及時(shí)救治,30%的嬰兒在嬰兒期死亡,即使存活也常繼發(fā)心、腦、肺等重要器官損害,嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量及身心健康,給家庭及社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)壓力和精神負(fù)擔(dān)。因此,深入探討胚胎心臟發(fā)育畸形的機(jī)制,從根本上控制和降低先心病的發(fā)生率,已成為預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域早期防治的一個(gè)重點(diǎn)研究內(nèi)容。先天性心臟病(CHD)的病因迄今尚未完全闡明,盡管多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CHD是胚胎心臟從原始心管到發(fā)育成熟過程中由環(huán)境和/或遺傳因素共同作用導(dǎo)致的發(fā)育異常,但研究發(fā)現(xiàn)單純由環(huán)境因素引起的CHD僅占2-5%,更多的則與遺傳或基因缺陷有關(guān)。心臟發(fā)育過程極其復(fù)雜,涉及許多相關(guān)基因依時(shí)空順序差次表達(dá)以及多條信號通路的精確調(diào)控,任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)紊亂都有可能影響心臟發(fā)育、導(dǎo)致CHD的發(fā)生。目前已發(fā)現(xiàn),Nkx2-5、GATA4、MEF2A、MEF2C、TBX5等基因以及Wnt、Notch等信號通路與心臟發(fā)育密切相關(guān),為理解先心病的發(fā)生發(fā)展提供了分子基礎(chǔ)與線索,但胚胎心臟發(fā)育異常的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全清楚,因此繼續(xù)挖掘新的調(diào)控因子仍極其重要。近年來,生命科學(xué)研究進(jìn)入后基因組時(shí)代,2003年9月的ENCODE計(jì)劃揭示,原先被認(rèn)為“轉(zhuǎn)錄噪音”的非編碼RNA,絕大部分也具備生物學(xué)功能,越來越引人關(guān)注。非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)極大拓展了人們對疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的理解,目前mi RNA(長度大約22nt、在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控編碼基因的非編碼RNA)的研究最為活躍,已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了mi RNA在心臟發(fā)育、心血管疾病中的重要作用與機(jī)制;而長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA,轉(zhuǎn)錄本長度大于200nt的非編碼RNA),由于:①種類、數(shù)量、功能、以及作用機(jī)制都遠(yuǎn)豐富于mi RNA;②具有基因修飾、染色體重組、m RNA穩(wěn)定性、表觀遺傳、基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)合成代謝及功能調(diào)節(jié)等重要生物學(xué)功能;③與胚胎發(fā)育及諸多疾病的發(fā)生密切相關(guān);④可能是RNA世界的一個(gè)調(diào)節(jié)樞紐,已引起研究人員的高度關(guān)注。盡管目前有關(guān)lnc RNA在心血管領(lǐng)域中的研究還鮮有報(bào)道,但毋容置疑,探索lnc RNA在心臟發(fā)育中作用與機(jī)制將進(jìn)一步加深對心臟發(fā)育機(jī)制的理解。第一部分心臟發(fā)育相關(guān)lnc NRAs的篩選與整合分析目的:1)檢測室間隔缺損胚胎心臟與正常對照心肌組織之間的lnc RNAs表達(dá)譜;2)篩選與心臟發(fā)育異常相關(guān)的lnc RNAs,為后續(xù)功能研究提供數(shù)據(jù)積累。方法:1)以超聲診斷為室間隔缺損的人孕17周胚胎心臟組織樣本為檢測對象、同孕周非疾病因素人工流產(chǎn)的胚胎心臟組織樣本為對照,采用美國Arraystar公司lnc RNAs芯片技術(shù)檢測兩組之間lnc RNAs和m RNAs的表達(dá)情況,對原始數(shù)據(jù)預(yù)處理、均一化后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以2倍以上變化且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)為判斷標(biāo)準(zhǔn),篩選出差異表達(dá)的lnc RNAs和m RNAs;2)隨機(jī)選取芯片結(jié)果中差異表達(dá)的10條lnc RNAs,采用Real-Time PCR方法驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)的重復(fù)性與可靠性;3)對差異表達(dá)的m RNAs進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析;4)依據(jù)序列保守性、心臟發(fā)育相關(guān)性、組織特異性等標(biāo)準(zhǔn),篩選出與心臟發(fā)育可能密切相關(guān)的lnc RNAs;5)對篩選出的lnc RNAs進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測其靶基因及潛在的生物功能。結(jié)果:1)對芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和兩組比較后,差異表達(dá)的lnc RNAs為1508條,其中上調(diào)880條,下調(diào)628條;差異表達(dá)的m RNA1784條,其中上調(diào)691條,下調(diào)1093條;2)RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)基本一致;3)GO分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)的lnc RNAS主要涉及發(fā)育過程、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)、糖分子綁定、蛋白綁定、細(xì)胞表面以及一些糖、脂代謝等功能。Pathway分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)的lnc RNAS參與的信號通路包括JAK-STAT signaling pathway、Wnt signaling pathway、Hedgelog signaling pathway等,這些信號通路與心臟發(fā)育密切相關(guān);4)通過制定的篩選標(biāo)準(zhǔn)共篩選出10條與心臟發(fā)育密切相關(guān)的lnc RNAs,它們都有較高的保守性與組織特異性,分別為:ENST00000513542、RP11-473L15.2、uc.167、HIT000242541、BX648912、BC040935、AY927503、LOC440839、G65566、AK127225;5)生物信息學(xué)分析顯示ENST00000513542、RP11-473L15.2這兩條lnc RNAs染色體區(qū)域存在豐富的表觀遺傳調(diào)控信息,包括多種組蛋白修飾方式、DNA甲基化等,并且受多個(gè)發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控。結(jié)論:1)與正常對照相比,室間隔缺損胚胎心肌組織中的lnc RNAs表達(dá)譜發(fā)生了顯著變化,提示lnc NRAs可能參與了心臟發(fā)育過程的調(diào)節(jié)。2)經(jīng)Real-time PCR驗(yàn)證,lnc RNAs芯片結(jié)果可靠,可用于后續(xù)分析。第二部分lnc RNA-uc.167的生物信息學(xué)分析及時(shí)空表達(dá)特征目的:1)采用生物信息學(xué)方法探索uc.167潛在功能的重要性;2)分析uc.167的基本生物學(xué)特征,包括uc.167在小鼠心臟發(fā)育過程中的空間分布特征、時(shí)間表達(dá)規(guī)律以及uc.167在P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中的時(shí)間表達(dá)規(guī)律。方法:1)借助ENCODE的UCSC genome browser對篩選出的lnc RNAs進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析;利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫預(yù)測與lnc RNAs結(jié)合TFBs的元件。采用cat RAPID algorithm預(yù)測RNA與蛋白之間相互作用;2)取不同階段(P8.5、P11.5、P14.5、P18.5)的胚胎小鼠心臟,使用RT-PCR方法檢測uc.167及鄰近基因在心肌組織中的表達(dá)情況,并采用原位雜交技術(shù)檢測uc.167在心肌組織內(nèi)的分布情況;3)采用DMSO方法誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞方向分化,采用RT-PCR方法檢測分化過程中uc.167及鄰近基因的表達(dá)變化。結(jié)果:1)人uc.167全長201bp,定位于基因組5q14.3(chr5:88179623-88179824,GRCh37/hg19),根據(jù)lnc RNA分類原則,屬Intronic antisense lnc RNA;2)uc.167相關(guān)染色體區(qū)域受CEBPB、GATA2、SRF等多個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控,該染色體區(qū)域存在非常豐富的表觀遺傳調(diào)控信息,如多種組蛋白修飾方式、DNA甲基化等;3)uc.167主要表達(dá)于心室肌組織內(nèi);在小鼠胚胎心臟發(fā)育過程中uc.167表達(dá)逐漸下調(diào),而其鄰近基因Mef2c表達(dá)逐漸上調(diào),兩者呈相反趨勢;4)uc.167在P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的過程中,呈現(xiàn)“先升后降”的表達(dá)模式,在胚胎樣小體形成(d4)時(shí)表達(dá)水平達(dá)到最高,而后逐漸下調(diào),臨近基因Mef2c的表達(dá)變化與其呈相反趨勢。結(jié)論:1)uc.167可能具有重要的潛在的生物學(xué)功能;2)uc.167可能通過負(fù)向調(diào)控其鄰近基因Mef2c來發(fā)揮作用。第三部分lnc RNA-uc.167在胚胎心臟發(fā)育中的功能與相關(guān)機(jī)制研究目的:1)探索uc.167對P19細(xì)胞增殖、周期、凋亡及分化的影響及相關(guān)機(jī)制;2)探索uc.167在小鼠心臟發(fā)育過程中的作用及可能機(jī)制。方法:1)設(shè)計(jì)并構(gòu)建lnc RNA-uc.167過表達(dá)載體,將其與空白對照載體分別轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞,并用嘌呤霉素篩選14d,采用RT-PCR方法驗(yàn)證并獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀檢測uc.167過表達(dá)對P19細(xì)胞周期的影響、RT-PCR方法檢測其對P19細(xì)胞分化的影響,并用磷脂酰外翻法、Capase-3活性檢測及Hoechst染色等方法分析其對細(xì)胞凋亡的影響;2)設(shè)計(jì)Mef2c過表達(dá)載體,與uc.167共轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞,檢測P19細(xì)胞增殖、周期、凋亡及分化情況;3)通過胚胎顯微注射方法構(gòu)建uc.167心肌組織特異性轉(zhuǎn)基因小鼠,采用心臟超聲、HE、Masson染色等實(shí)驗(yàn)技術(shù)對其表型進(jìn)行初步分析。結(jié)果:1)成功構(gòu)建uc.167過表達(dá)載體并獲得uc.167穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株,uc.167過表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞增殖,使其受阻于S/G2期,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,uc.167過表達(dá)顯著抑制P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞方向分化;2)Mef2c與uc.167共同過表達(dá)可挽救uc.167過表達(dá)對P19細(xì)胞造成的不利影響;3)在觀察期內(nèi),uc.167轉(zhuǎn)基因小鼠并未出現(xiàn)明顯的心臟畸形表型:與正常對照相比,轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟結(jié)構(gòu)、心功能參數(shù)均無明顯變化;心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、纖維化程度也未發(fā)生顯著變化。結(jié)論:1)uc.167過表達(dá)可產(chǎn)生明顯的細(xì)胞表型,顯著影響P19細(xì)胞的增殖、周期、凋亡及細(xì)胞分化;2)uc.167可能通過負(fù)向調(diào)控其臨近基因Mef2c發(fā)揮生物學(xué)功能;3)uc.167在心臟發(fā)育過程中具有一定的調(diào)節(jié)作用,但并不是唯一性、關(guān)鍵性的,而是可能作為一個(gè)“微效基因”與其他基因共同發(fā)揮調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R541.1

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本文編號：2780366