發(fā)布時間：2020-08-03 07:07

【摘要】：研究背景及目的膽汁淤積(cholestasis)是多種疾病和生理狀態(tài)所致的常見臨床綜合癥,其病因包括如：(病毒性和非病毒性)肝炎(hepatitis)、肝硬化(liver cirrhosis)、脂肪肝(fatty liver)、感染(infection)、膽道阻塞(bile duct obstruction)、遺傳病(genetic diseases)、孕娠(pregnant)等。在膽汁淤積狀態(tài)下,肝細胞內(nèi)不斷積聚的毒性膽汁酸(toxic bile acids)造成肝臟損傷,激發(fā)肝臟產(chǎn)生適應性反應(Adaptive responsive),即膽汁酸代謝基因表達發(fā)生適應性改變：(1)Phase 0(攝入)相Ntcp、Oatps等表達下降,減少膽汁酸向肝細胞內(nèi)泵入；(2)Phase Ⅰ(合成)相Cyp7a1、Cyp8b1等膽汁酸合成相關(guān)的酶類表達下調(diào),減少肝細胞內(nèi)膽汁酸的生成；(3)Phase Ⅱ(解毒)相Ugts、 Sults、 Gsts等膽汁酸硫酸化、葡萄糖苷化、谷胱甘肽化有關(guān)的酶表達增強,從而增加膽汁酸的水溶性、降低膽汁酸的毒性；(4)Phase Ⅲ(排泌)相的膽酸相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白Mrp3、Mrp、Ostα/β的表達顯著上調(diào),增強肝細胞內(nèi)膽汁酸的排泌,減少毒性膽汁酸在肝細胞內(nèi)的積聚。然而,目前對于膽汁淤積適應性反應的分子機制的認知,主要來源于動物實驗或體外細胞培養(yǎng)。由于活體動物、體外細胞培養(yǎng)的環(huán)境均與人體存在顯著差異。因此,對于阻塞性膽汁淤積下肝臟是否產(chǎn)生適應性反應以及其具體的分子機制尚不清楚。尤其值得注意的是膽酸轉(zhuǎn)運蛋白MRP2/ABCC2,其定位表達于肝細胞膽管面膜,主要排泌結(jié)合膽紅素、膽汁酸等有機陰離子化合物。但是,MRP2單基因缺失或突變會導致以高膽紅素血癥和膽汁酸增高為主要癥狀的Dubin-Jonhson綜合征[。因此,MRP2在膽汁淤積發(fā)生、發(fā)展中功能極其重要。近期文獻報道,雌激素誘導的膽汁淤積大鼠肝臟Mrp2 mRNA和總蛋白水平表達無明顯變化,而肝細胞膽管面膜Mrp2表達顯著減少。前期研究也表明,阻塞性膽汁淤積下肝臟MRP2 mRNA表達也無明顯變化。因此,我們推測阻塞性膽汁淤積下肝臟MRP2蛋白表達減少可能為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。有動物實驗研究表明,細胞骨架蛋白Radixin基因缺失會導致小鼠肝細胞膽管面膜Mrp2表達缺失,從而引起高膽紅素血癥。有細胞水平實驗研究表明,Radixin和Ezrin基因敲減可顯著減少人腸上皮細胞株Caco2細胞膜上的MRP2蛋白的表達。此外,Ezrin Thr567磷酸化與大鼠腸道上皮細胞頂膜MRP2蛋白定位表達密切相關(guān),而且PKCa具有決定其表達定位的作用。并且,膽汁淤積動物模型肝臟PKC被活化,能夠在不影響肝臟MRP2 mRNA表達的情況下而減少肝細胞膜上MRP2蛋白的表達。最新研究表明,蛋白激酶C (PKC)可誘導乳腺癌細胞株MCF-7的Ezrin Thr567磷酸化[24]。因此,我們提出人阻塞性膽汁淤積下肝臟MRP2轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的分子機制假設(shè)：阻塞性膽汁淤積時,肝臟蛋白激酶PKC被活化,誘導骨架蛋白Ezrin Thr567磷酸化,促使肝細胞膽管面膜MRP2內(nèi)吞,最后經(jīng)由蛋白酶體降解途徑(ERAD)降解。在本研究中,我們收集人阻塞性膽汁淤積組和正常對照組病人肝臟組織,運用Realtime qPCR(SYBR)、 Western-blot、免疫共沉淀、免疫熒光、免疫組化、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株等技術(shù),闡明人阻塞性膽汁淤積肝臟的適應性反應以及驗證MRP2轉(zhuǎn)錄后下調(diào)的分子機制假設(shè)。研究方法1.收集人阻塞性膽汁淤積組和正常對照組肝臟組織,一部分用4%多聚甲醛固定；一部分剪成小塊后,凍存于液氮罐保存,用于總RNA、總蛋白、總膜蛋白、核蛋白等提取。2. Real time qPCR(SYBR)檢測阻塞性膽汁淤積組、對照組肝臟膽汁酸合成酶(CYP7B1、CYP8B1、CYP27A1),肝臟解毒酶(UGT2B4/7、SULT2A1、GSTA1-4、 GSTA1-5、肝細胞基底側(cè)膜膽酸轉(zhuǎn)運蛋白(OSTα/β、OCT1)、肝細胞膽管面膜轉(zhuǎn)運蛋白(ABCG2、ABCG5/8)以及調(diào)節(jié)相關(guān)核受體(VDR、PPARα、HNF1α、HNF4α、RXRα) RARα、LXR、FXR、SHP)和核轉(zhuǎn)錄因子(NF3β、NRF2β、AHR)的mRNA水平的表達情況。3. Western-blot檢測上述基因在阻塞性膽汁淤積組和正常對照組的蛋白表達水平。4.免疫熒光檢測膽酸轉(zhuǎn)運蛋白OSTα/β、OCT1、ABCG2、ABCG8和核受體VDR、HNF4α、RARα、FXR在阻塞性膽汁淤積組和正常對照組的蛋白表達定位情況。5. Real time qPCR(SYBR)檢測阻塞性膽汁淤積組、對照組肝臟骨架蛋白(Ezrin、 Radixin)、蛋白激酶C(PKCα、PKCδ、PKCε)、泛素連接酶E3s(gp78、TEB4、HRD1)的mRNA水平的表達情況。6. Western-blot檢測上述基因在阻塞性膽汁淤積組、對照組的蛋白表達情況。同時還檢測,Ezrin Thr567磷酸水平的情況。7.免疫熒光和免疫組化檢測MRP2、Ezrin、磷酸化Ezrin Thr567在阻塞性膽汁淤積組、對照組肝臟表達定位情況。8.通過免疫共沉淀技術(shù),研究Ezrin(磷酸化Ezrin Thr567)、Radixi、PKCα、PKCδ PKCε、 MRP2泛素化之間的相互作用。9.構(gòu)建Ezrin野生型及突變體、PKCa野生型及突變體等HepG2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株后,通過Real time qPCR、Western-blot等檢測其mRNA、總蛋白、總的膜蛋白和生物素標記的膜蛋白的MRP2表達情況。結(jié)果1.阻塞性膽汁淤積下膽汁酸合成經(jīng)典途徑(CYP7A1)被抑制；而替代途徑(CYP7B1、CYP8B1)被激活。2.阻塞性膽汁淤積下肝臟解毒酶UGT2B、SULT2A1、GSTA1-4、GSTM1-4蛋白表達顯著減少。3.阻塞性膽汁淤積下肝細胞基底側(cè)膜OSTβ、OCT1表達顯著增高、OSTα蛋白表達明顯減少；膽管面膜ABCG2、ABCG8表達顯著減少。4.阻塞性膽汁淤積下肝臟核受體FXR表達顯著減少；VDR、RARα、HNF4α表達顯著增加。5.阻塞性膽汁淤積下核受體FXR表達顯著減少,與肝臟解毒酶UGT2B、SULT2A1、GSTA1的表達減少存在顯著正相關(guān)。6.阻塞性膽汁淤積下肝細胞膽管面膜MRP2表達顯著減少；總蛋白MRP2表達也明顯減少。7.阻塞性膽汁淤積下肝細胞骨架蛋白Radixin和Ezrin表達無明顯變化。但是,EzrinThr567磷酸化水平在膽汁淤積肝臟顯著增高,其脫磷酸化可影響Ezrin與MRP2蛋白間的相互作用。在HepG2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株水平,Ezrin Thr567磷酸化可明顯減少肝細胞膜MRP2的表達。8.阻塞性膽汁淤積下PKC在mRNA和蛋白水平表達顯著增加。而通過肝臟組織樣品和細胞水平的實驗證明,PKCa可誘導Ezrin Thr567磷酸化,同時減少肝癌細胞HepG2細胞膜上MRP2的表達。9.阻塞性膽汁淤積下泛素連接酶E3 gp78表達和MRP2泛素化明顯增加。在HepG2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株,gp78干擾后可增強總蛋白MRP2的表達。結(jié)論通過本研究表明,阻塞性膽汁淤積時,肝臟產(chǎn)生自我保護、適應性反應,一方面激活膽汁酸替代途徑(如CYP7B1、CYP8B1增高),另一方面增強肝細胞內(nèi)膽汁酸排泌(如OSTβ增高),減輕肝臟損傷。但是,由于肝臟解毒酶(如UGT2B、SULT2A1、GSTA1)的表達顯著降低,從而消弱了適應性反應的效果。我們通過分析發(fā)現(xiàn),阻塞性膽汁淤積下肝臟核受體FXR的減少與肝臟解毒酶表達(如UGT2B、SULT2A1、GSTA1)降低存在顯著正相關(guān)。這提示,FXR在阻塞性膽汁淤積下肝臟解毒功能消弱發(fā)揮重要的作用。而且,這也能很好的解釋,FXR激動劑(如UDCA、INT747)為何具有減輕膽汁淤積病人肝損傷的效果。此外,我們通過研究還發(fā)現(xiàn),阻塞性膽汁淤積下肝臟MRP2表達下調(diào)為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,其可能的分子機制：首先,蛋白激酶PKC(PKCα、PKC8、PKCε)表達增高和激活；其次,PKC誘導Ezrin Thr567發(fā)生磷酸化,從而增強Ezrin與肝細胞膽管面膜MRP2的蛋白間相互作用；然后,磷酸化的Ezrin Thr567促使細胞膽管面膜MRP2內(nèi)吞；最后,內(nèi)吞至肝細胞內(nèi)的MRP2蛋白經(jīng)由泛素連接酶E3 gp78介導的蛋白酶體降解途徑降解。理解和弄清楚膽汁淤積表達下調(diào)的分子機制具有極其重要的意義,不僅僅可加深我們對膽汁淤積發(fā)生、發(fā)展的分子機制的理解,而且也能為我們研發(fā)新的治療藥物和靶向治療提供了新的重要線索。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575
【圖文】：

焌積肝臟組織ｍＲＮＡ和蛋白水平表達均顯著降低［其它與學位論文相關(guān)的論著１］。與此逡逑截然相反，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)膽汁酸合成酶ＣＹＰ７Ｂ１在阻塞性膽汁游積肝臟ｎｉＲＮＡ逡逑和蛋白水平表達均顯著增高（６．４倍和２．４倍，尸＜０．０１）（圖１－１Ａ－Ｃ）。同時，另一膽汁酸合逡逑成酶ＣＹＰ犯１在蛋白水平表達也顯著增高（２．８倍，ｆ＜０．（Ｈ）調(diào)１－１Ｂ、Ｃ），但是在其ｍＲＮＡ逡逑水平無明顯變化（圖１－１Ａ）。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，阻塞性膽汁焌積肝臟膽汁酸合成酶逡逑ＣＹＰ２７Ａ１在ｍＲＮＡ和蛋白水平表達均無明顯變化圖１－１Ａ－Ｃ）。逡逑Ｗ上結(jié)果表明，人阻塞性膽汁焌積下，肝臟膽汁酸經(jīng)典合成途徑受到明顯抑制，而逡逑膽汁酸合成替代途徑被激活。這一方面有利于減少膽汁酸的合成，另一方面還能促使膽逡逑汁酸合成由巧細胞毒性較大的ＣＤＣＡ轉(zhuǎn)向毒性較小的ＣＡ。逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｃ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｌｉｖｅｒｓ邐Ｃｉ邋Ｃ２＾３邋Ｃ＊邋Ｏｉ邋Ｏ２邋Ｏｓ邋0４邋Ｏ＾Ｏｅ邐Ｈ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｌｉｖｅｒｓ逡逑■邋Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ邋ｃｈｏｌｅｓｔａｔｉｃ邋ｌｉｖｅｒｓ邐灥＾邋秦呵＇邋＇

肝臟膜蛋白ＭＲＰ２的表達在膽汁游積病人組顯著降低至正常對照組水平的逡逑２５％（戶＜０．０１，國２－１Ａ、Ｃ）。同時，阻塞性膽汁焌積組中肝臟總蛋白ＭＲＰ２的表達也明逡逑顯下降至對照組表達水平的６０％（戶＜０．０１，圖２－１Ｂ、Ｃ）。免疫組化檢測顯示，在阻塞性逡逑膽汁游積下，肝細胞膽管面膜ＭＲＰ２的蛋白表達顯著減少（圖２－ｌＤａ、ｂ）。同時，我還發(fā)逡逑現(xiàn)，在膽汁游積下，肝細胞膽管面膜ＭＲＰ２的表達存在明顯的內(nèi)吞（ｉｎｔｅｍａｌｚｉａｔｉｏｎNB圖逡逑２－ｌＤａ＾箭頭）。為了驗證觀察到的該現(xiàn)象是否準確，我們進行了邋ＭＲＰ２與ＺＯ－１松認的逡逑膽管面膜標記ｍａｒｋｅｒ之一）免疫巧光雙標。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，在膽汁焌積下斤細胞膽管面逡逑膜ＭＲＰ２表達顯著減少，送與我們在免疫組化觀察到的結(jié)果相一致調(diào)２－１巧。同時，我逡逑還發(fā)現(xiàn)，肝細胞膽管面膜結(jié)構(gòu)在膽汁焌積下被破壞，ＭＲＰ２與ＺＯ－１強合顯著減少，ＭＲＰ２逡逑并存在內(nèi)吞現(xiàn)象（圖２－１巧。逡逑前期研究及本次研究結(jié)果表明

ｓｈＲＮＡ＃３邋質(zhì)粒效果最佳（／■＜０．０５，圖邋２－２Ａ）。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ邋結(jié)果表明，ＥｚｒｉｎｓｈＲＮＡ＃３邋質(zhì)逡逑粒能明顯敲減ＨｅｐＧ２細胞骨架蛋白Ｅｚｒｉｎ的蛋白表達，而對ＭＲＰ２怠蛋白表達無明顯影逡逑響（尸＜０．０１，圖２－２Ｂ）。然后，我們利用Ｍｅｍ－ＰＥＲ膜蛋白提取試劑提取細胞總的膜蛋白，逡逑并做Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ檢測。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，Ｅｚｒｉｎ邋ｓｈＲＮＡ＃３穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Ｈ巧Ｇ２細胞總的膜逡逑蛋白ＭＲＰ２表達明顯增高２．２倍（ｆ＜０．０５，圖２－２Ｃ）。為了驗證該結(jié)果的準確性，我們利逡逑用邋ＥＺ－ＬｉｎｋＴＭＳ山ｆｏ－ＮＨＳ－ＳＳ－Ｂｉｏｔｉｎ邋和邋Ｐｉｅｒｃｅ⑥邋Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ邋Ａｇａｒｏｓｅ邋Ｒｅｓｉｎｓ邋試劑對邋Ｈｑ）Ｇ２逡逑穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株進行生物素化標記后，提取生物素化標記的細胞膜蛋白進行ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ逡逑檢測。與前述結(jié)果相一致，我們發(fā)現(xiàn)Ｅｚｒｉｎ邋ｓｈＲＮＡ沿干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的Ｈｑ）Ｇ２細胞生逡逑物素標記的膜蛋白ＭＲＰ２表達明顯X椄擼玻保ㄊ跡埃埃�，哇E玻睬傘ｅ義希咨轄峁礱鰨牛潁椋鑠澹螅瑁遙危亮現(xiàn)柿Ｄ芄幌災眉酰齲澹穡牽蠶赴羌艿鞍祝牛潁椋畹謀礤義洗鎩＃牛潁椋罨蚯眉鹺�，能够X椙浚齲澹穡牽蠶赴さ鞍祝停遙校駁謀澩錚宰艿鞍祝停遙校插義媳澩鏤廾饗雜跋�。这提�

本文編號：2779284