【摘要】：結腸癌是發(fā)達國家的常見惡性腫瘤,也是我國常見的九大惡性腫瘤之一。在過去的30多年時間里,隨著發(fā)展中國家城市化水平的進程,包括我國在內的多數(shù)國家或地區(qū)結腸癌發(fā)病率呈上升趨勢。近十年來,隨著手術、放療和化療的進步,早中期結腸癌治療效果有了明顯提升。然而手術僅對未轉移腫瘤的治療效果好,中晚期腫瘤采用放療5年生存率低于15%,采用化療5年生存率更低,這主要是由于腫瘤的復發(fā)和轉移�；熕幬镌跉麗盒阅[瘤細胞的同時,對機體的正常細胞有不同程度的毒副作用及耐藥性。因此,從天然產(chǎn)物中尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物一直是研究者關注的焦點。地皮菜,拉丁名為Nostoc commune Vauch.,別名地耳、地踏菇、地衣、地木耳、地軟等,在我國各地都有分布。地皮菜是可以食用的一種藍藻,營養(yǎng)豐富,含有人體所必需的八種氨基酸,蛋白質、VC、鐵、鈣等的含量甚至超過了木耳和銀耳,具有重要的保健和醫(yī)療的重要價值。本研究以地皮菜為原料,利用生物化學技術從地皮菜蛋白粗提液中獲得了單一的抗腫瘤活性蛋白組分,經(jīng)質譜鑒定屬于水應激蛋白(water stress protein,WSP)家族,命名為WSP1。應用細胞及裸鼠模型,從細胞增殖、細胞周期阻滯、細胞凋亡及細胞遷移等方面,研究了WSP1抑制結腸癌細胞生長和遷移的分子機制。此外,采用重組基因工程技術,將地皮菜水應激蛋白經(jīng)原核表達系統(tǒng)表達純化,鑒定了所獲重組蛋白(Re-WSP1)的氨基酸序列和抗腫瘤活性。主要研究內容及結果如下：(1)采用丙酮沉淀和硫酸銨沉淀法制備地皮菜粗蛋白,得到單一的蛋白組分。經(jīng)MALDI-TOF/MALDI-TOF/TOF質譜鑒定和基因序列分析,確定該蛋白組分為水應激蛋白,命名為WSP 1 (water stress protein 1, WSP 1)。(2)采用MTT法分析WSP1對人結腸癌細胞株DLD1、HCT116、SW480、HT29和人正常結腸上皮細胞株FHC增殖的影響。結果表明,WSP1抑制了結腸癌細胞的增殖,對正常結腸上皮細胞無顯著作用。分子機制研究顯示,WSP1通過下調c-Myc, cyclinD1, cyclinE1和p-Rb的表達水平,引起結腸癌DLD1細胞周期在G1期阻滯,導致細胞生長抑制。采用DAPI染色法和Annexin V/碘化丙啶雙染法檢測WSP1處理對細胞凋亡的影響。結果顯示,WSP1處理后,DLD1和HCT116細胞核出現(xiàn)典型的凋亡小體,并且其早期凋亡率顯著高于對照組,表明WSP1能夠靶向誘導結腸癌細胞凋亡。(3)通過檢測線粒體膜電位和caspase家族蛋白的表達量,進一步確定了WSP1誘導凋亡的分子機制。結果表明,經(jīng)WSP1處理后,促凋亡蛋白Bax表達上調、抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降,DLD1細胞的線粒體膜電位顯著下降；caspase-8、caspase-9和caspase-3被顯著激活,caspases的切割底物DNA修復酶PARP降解。加入廣譜caspase抑制劑z-VAD-FAK后,WSP1誘導的細胞凋亡被明顯逆轉。(4)采用細胞劃痕法檢測了WSP1對DLD1和FHC細胞遷移的影響。結果顯示,WSP1能夠顯著抑制結腸癌DLD1細胞的遷移,而對正常結腸上皮細胞FHC無顯著影響。進一步研究表明,WSP1首先抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路,誘導DLD1細胞發(fā)生自噬；激活的自噬進一步導致β-catenin降解及其下游效應分子的表達改變,最終引起DLD1細胞發(fā)生間質-上皮轉化(Mesenchymal-Epithelial Transition, MET)。采用自噬的特異性抑制劑氯喹檢驗上述結果,所得數(shù)據(jù)表明,WSP1誘導的自噬是WSP1抑制細胞遷移的關鍵路徑。(5)通過PCR技術,從地皮菜中得到WSP1的基因,序列號為KF003026。利用重組基因工程技術,將WSP1基因克隆到原核表達系統(tǒng),獲得了表達工程菌。經(jīng)親和純化濃縮獲得重組水應激蛋白(recombinant water stress protein, Re-WSP1)。結果顯示,Re-WSP1對結腸癌SW480細胞的生長具有顯著抑制作用,與從地皮菜中獲得的天然水應激蛋白具有相同的生物活性。因此,Re-WSP1的研究可以為天然水應激蛋白抗癌藥物的研發(fā)奠定基礎。(6)用結腸癌DLD1細胞建立了裸鼠皮下成瘤模型,通過腹腔注射的方法,定期進行WSP1給藥處理(共6次)。結果顯示,WSP1處理裸鼠能夠顯著抑制結腸癌腫瘤的生長。采用免疫組化的方法對腫瘤組織中與細胞增殖、凋亡和遷移的相關指標進行檢測,包括Ki-67、caspase-8、caspase-9、PARP、β-catenin、E-cadherin和N-cadherin,其結果與細胞實驗結果一致。本研究結果顯示,WSP1通過誘導結腸癌細胞發(fā)生G1期阻滯而抑制其增殖；經(jīng)caspase依賴的途徑誘導結腸癌細胞發(fā)生凋亡；通過誘導自噬抑制β-catenin介導的EMT來抑制結腸癌細胞的遷移；裸鼠模型結果與細胞實驗實驗結果一致；重組水應激蛋白具有與天然水應激蛋白一樣的生物活性。因此,WSP1有可能作為一種有效的天然抗腫瘤藥物進行深度開發(fā)和利用。
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R943

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