【摘要】：聚羥基脂肪酸酯(PHA)因具有很多優(yōu)良的性能,而被作為一種生物材料應(yīng)用于醫(yī)藥等很多領(lǐng)域。它是一類碳源和能源的貯藏材料,它們?cè)谔荚催^剩、其他大量元素(N、O、P、S)被耗盡的情況下,可以由一大類種類各異的微生物合成。PHA是由含有不同碳鏈長度的單體即3-羥基脂肪酸(3-hydroxyalkanoate, 3HA)聚合而成的。隨著目前追求“綠色聚合物”的潮流日益興盛,PHA作為一類生物可降解,具有生物兼容性的環(huán)境友好型材料,已經(jīng)被用來作為石油基塑料的替代品,而引起廣泛的研究興趣。因?yàn)槿藗儗?duì)原油價(jià)格不斷攀升越來越關(guān)注,加之石油資源的耗盡和由塑料造成的環(huán)境污染越來越嚴(yán)重,PHA的生產(chǎn)與合成就越來越受到研究者和工業(yè)領(lǐng)域的關(guān)注。目前為止,已經(jīng)有超過150種的PHA單體組成得以報(bào)道。大腸桿菌作為一種模式生物,已經(jīng)被廣泛用來生產(chǎn)各種為人類所用的高附加值產(chǎn)品,如生物燃料、生物材料、大宗化學(xué)品等。盡管自然條件下,大腸桿菌無法合成PHA,但是大腸桿菌仍然被認(rèn)為是PHA合成的理想宿主。用于合成PHA的結(jié)構(gòu)相關(guān)碳源即脂肪酸,一般說來,都是高成本,對(duì)細(xì)胞有毒性,且不溶于水的。因此,很多研究學(xué)者們都開始致力于通過整合不同生物體的基因,去發(fā)現(xiàn)利用非相關(guān)碳源合成PHA的新代謝途徑。根據(jù)單體中所含的碳原子組成數(shù)目的不同,PHA可以被分成三種主要的類型：1.短鏈長的PHA即scl-PHA,含有3-5個(gè)碳原子；2.中鏈長的PHA即mcl-PHA,含有6-14個(gè)碳原子；3.短、中鏈長單體共聚的PHA即scl-mcl PHA,含有3-14個(gè)碳原子。根據(jù)PHA的性質(zhì),可以在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮很大的潛能,如在整形醫(yī)學(xué)方面,可以作為螺絲,軟骨組織工程支架,骨移植的替代物。在心血管醫(yī)學(xué)方面,可以作為系統(tǒng)裝置如血管替代物、心臟瓣膜、心血管支架、心房和心包間隔的修復(fù)補(bǔ)丁。在創(chuàng)傷管理方面,可以用作皮膚的替代物、手術(shù)縫合線、醫(yī)用敷料、隔離劑等。除上述一系列功用之外,PHA還可以作為泌尿支架、納米或微球用以控制藥物的傳遞。既然PHA具有這么廣泛而重要的應(yīng)用,因此我們更要構(gòu)建新的PHA高效合成平臺(tái),使其能夠利用廉價(jià)碳源高產(chǎn)含不同鏈長、不同類型單體的PHA,以適應(yīng)不同應(yīng)用領(lǐng)域的需求。傳統(tǒng)的scl-PHA如PHB生產(chǎn)應(yīng)用的是三步法,產(chǎn)量較高,已經(jīng)用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。而mcl-PHA的生產(chǎn)主要是通過脂肪酸p-氧化和脂肪酸從頭合成途徑實(shí)現(xiàn)的。這兩個(gè)途徑分別有自己的合成缺陷,脂肪酸p-氧化途徑是以脂肪酸為碳源來合成PHA。而脂肪酸是一種較昂貴的碳源且對(duì)微生物細(xì)胞有毒害作用,因此利用該途徑合成PHA具有很大的限制。而脂肪酸從頭合成途徑雖然是利用碳水化合物為碳源生產(chǎn)PHA,但是細(xì)胞內(nèi)積累的PHA含量較低�；谏鲜龅脑�,迫切需要構(gòu)建一個(gè)利用廉價(jià)、不相關(guān)碳源高效生產(chǎn)PHA的平臺(tái),從而提供充足的(R)-3-羥�；�-CoA底物。本研究著眼于解決上述問題,在重組大腸桿菌中構(gòu)建了逆向脂肪酸β-氧化循環(huán)中所需酶的過表達(dá)質(zhì)粒,試圖直接利用葡萄糖為碳源,通過構(gòu)建的逆向脂肪酸β-氧化循環(huán),合成含有不同單體的mcl-PHA共聚物。當(dāng)在單敲除硫酯酶基因的菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加30gl-1葡萄糖時(shí),敲掉tesB基因的菌株合成的mcl-PHA含量最高,約占細(xì)胞干重的4.01%；敲除yciA基因的菌株次之,約占細(xì)胞干重的2.04%；敲除tesA基因的菌株合成的mcl-PHA含量最低。同時(shí),我們嘗試?yán)闷渌畠r(jià)、非相關(guān)碳源如木糖進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。結(jié)果表明,以30gl-1木糖為唯一碳源時(shí),三種單敲除硫酯酶基因的菌株在轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pQQ05后,均能合成mcl-PHA,產(chǎn)量最高為2.33 wt%,但低于相應(yīng)菌株以葡萄糖為碳源時(shí)的含量。另外,因?yàn)樵诔霭l(fā)菌株的基礎(chǔ)上,我們敲除了編碼大腸桿菌葡萄糖特異的PTS系統(tǒng)的關(guān)鍵酶即酶IIBC的組分基因ptsG,所以解除了大腸桿菌中的碳源代謝阻遏現(xiàn)象,使得葡萄糖和木糖可以同時(shí)被利用。因此,我們又在培養(yǎng)基中同時(shí)添加15gl-1葡萄糖和15gl-1木糖作為碳源,在三種單敲除硫酯酶基因的菌株中轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pQQ05進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn),結(jié)果表明三種單敲除硫酯酶基因的菌株均能合成mcl-PHA聚合物,且產(chǎn)量均高于單獨(dú)利用木糖為碳源的mcl-PHA合成量。為了進(jìn)一步提高產(chǎn)量,本研究在重組大腸桿菌中同時(shí)敲除了兩個(gè)硫酯酶基因,得到雙敲除菌株。在LZ05(△tesB△yciA)中轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pQQ05, mcl-PHA含量達(dá)到6.62 wt%,在LZ06(AtesBAtesA)中轉(zhuǎn)入相同質(zhì)粒,mcl-PHA含量達(dá)到6.28wt%,而在LZ07(AtesAAyciA)中轉(zhuǎn)入pQQ05積累的mcl-PHA含量最低,約占細(xì)胞干重的5.07%。三種菌的生長狀況良好,細(xì)胞干重均在6gl-1以上。為了得到既含短鏈單體又含中鏈單體的PHA即scl-mcl PHA,我們用來自Pseudomonas stutzeri 1317的低底物特異性的PHA聚合酶-PhaC2Ps替換合成mcl-PHA的來自Pseudomonas aeruginosa PAO1的PHA聚合酶-PhaC2Pa,構(gòu)建了pQQ06質(zhì)粒。在菌株LZ05中轉(zhuǎn)入pQQ06后,在添加30gl-1的葡萄糖的情況下,能夠合成占細(xì)胞干重約12.10%的scl-mcl PHA,其中3HB占21.18 mo1%和中鏈單體占78.82 mo1%。該生產(chǎn)途徑可以在經(jīng)過優(yōu)化之后用于工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。上述所有合成的PHA都只是含有偶數(shù)鏈單體的PHA,且已經(jīng)顯示出理想的物理和機(jī)械性能,如果在其中增加奇數(shù)鏈單體的組分能夠賦予該種生物材料更高的強(qiáng)度和柔韌性,使其更具有新穎性和實(shí)用性。鑒于此,就特別需要構(gòu)建一個(gè)高效的PHA生物合成途徑,使其能合成含奇數(shù)鏈單體mcl-PHA所需的相應(yīng)奇數(shù)鏈(R)-3-羥�；�-CoA前體。迄今為止,還沒有利用葡萄糖和丙酸在大腸桿菌中積累含有不同長度奇數(shù)鏈單體的mcl-PHA的報(bào)道出現(xiàn)�；谶@個(gè)原因,利用廉價(jià)碳源,有功能的逆向脂肪酸p-氧化途徑就被用來提供兩個(gè)碳原子延伸的�；�-CoA前體來合成不同奇數(shù)鏈長的(R)-3-羥酰基-CoA,從而改變僅能添加相關(guān)碳源-奇數(shù)碳脂肪酸生產(chǎn)奇數(shù)鏈前體的局面。在本研究中,PHA生產(chǎn)的代謝途徑包括產(chǎn)生偶數(shù)鏈單體和奇數(shù)鏈單體的兩個(gè)平行的模塊。我們構(gòu)建了一個(gè)能夠利用葡萄糖和丙酸產(chǎn)生從C7到C13奇數(shù)鏈單體的mcl-PHA生產(chǎn)途徑。為了提供奇數(shù)鏈單體的前體,在本研究中又克隆了來自R. eutropha H16的prpP、prpE和pct基因以及來自E. coli MG1655的aCs基因。將PCR擴(kuò)增得到的上述4個(gè)基因與載體pBBR1MCS2連接,構(gòu)建了四個(gè)質(zhì)粒,即pZQ01, pZQ02, pZQ03和pZQ04。在構(gòu)建奇數(shù)鏈前體供給的工程化途徑中,可以通過丙酸透過酶(PrpP)攝取丙酸。同時(shí),丙酸也可以直接由丙酰-CoA合成酶(PrpE/Acs)激活或通過丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶(Pct)的作用將3-羥基戊酰-CoA單元插入到延伸的聚合物鏈中,最后再由從P. aeruginosa PAO1中克隆的編碼PHA合成酶的vhaC2Pa將單體聚合生成既含有奇數(shù)鏈單體又含有偶數(shù)鏈單體的mcl-PHA.為了分析基因prpP, acs, prpE和pct對(duì)mcl-PHA生產(chǎn)中奇數(shù)鏈單體含量大小的作用,本研究分別共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pQQ05和pZQ01,pQQ05和pZQ02, pQQ05和pZQ03,pQQ05和pZQ04進(jìn)入改造的大腸桿菌菌株LZ05中。之所以使用菌株LZ05,是因?yàn)槠洚a(chǎn)生偶數(shù)鏈mcl-PHA的含量最高。搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)是在30℃,250 rpm的轉(zhuǎn)速條件下,加入30gl-1葡萄糖和1.5gl-1丙酸到轉(zhuǎn)化上述組合質(zhì)粒的重組菌株LZ05培養(yǎng)基中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)都能夠積累含有偶數(shù)和奇數(shù)鏈單體的mcl-PHA。與其他三個(gè)組合的質(zhì)粒進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),菌株LZ05含pQQ05和pZQ03積累mcl-PHA的含量最高。此外,工程化構(gòu)建的含有質(zhì)粒pQQ05和pZQ01的菌株LZ05合成了占細(xì)胞干重大約3.21%的mcl-PHA,而且該菌株含有高達(dá)11.24 mol%的最高奇數(shù)鏈mcl-PHA單體產(chǎn)量,其中3-羥基庚酸(3HHp)單體含量約占mcl-PHA的6.46 mmol%。這些結(jié)果表明,基因prpP, acs, prpE和pct對(duì)mcl-PHA的產(chǎn)量具有不同的影響。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,該菌株仍然沒有足夠的分子起始奇數(shù)鏈單體的形成。為了提高重組大腸桿菌中mcl-PHA的產(chǎn)量和擁有更多的奇數(shù)鏈單體,我們通過構(gòu)建質(zhì)粒pZQ05, pZQ06和pZQ07,重建了mcl-PHA的生物合成途徑。由于過表達(dá)prpP時(shí)獲得了最高含量的奇數(shù)鏈單體,所以在上述質(zhì)粒中,prpP和acs,prpP和prpE, prpP和pct兩兩基因同時(shí)被分別過表達(dá)。然后,它們都是與質(zhì)粒pQQ05共轉(zhuǎn)化到菌株LZ05中,形成LZ05(pQQ05, pZQ05), LZ05(pQQ05, pZQ06)和LZ05(pQQ05, pZQ07)。培養(yǎng)這些菌株之后發(fā)現(xiàn),它們表現(xiàn)出了不同的生長現(xiàn)象且合成了不同含量的mcl-PHA.在菌株LZ05中共轉(zhuǎn)入雙質(zhì)粒pQQ05和pZQ05時(shí),細(xì)胞干重最高可達(dá)6.90 gl-1,比用prpP或aCs單基因過表達(dá)時(shí)的菌株高。然而,當(dāng)LZ05共轉(zhuǎn)入雙質(zhì)粒pQQ05和pZQ06(或pZQ07)時(shí)的細(xì)胞干重只達(dá)到6.69 gl-1(或6.31 gl-1)。這些結(jié)果表明,prpP和aCs的過表達(dá)有利于細(xì)胞生長。至于mcl-PHA的含量,上述菌株各有不同。LZ05(pQQ05, pZQ06)積累了占細(xì)胞干重4.96%的mcl-PHA聚合物,是在上述三種菌株中最高的。然而,在LZ05(pQQ05, pZQ06)中奇數(shù)鏈組分約占10.98%的摩爾百分含量,比LZ05(pQQ05, pZQ01)低。為了進(jìn)一步提高產(chǎn)量,我們又在LZ05菌株中敲除了poxB和pflB基因,構(gòu)建了LZ08菌株。將pQQ05和pZQ06質(zhì)粒轉(zhuǎn)入LZ08,經(jīng)搖瓶發(fā)酵、GC檢測,發(fā)現(xiàn)該重組菌株能夠以30gl-1葡萄糖和2gl-1丙酸為碳源,積累約6.23 wt%的mcl-PHA,其中奇數(shù)鏈單體含量占20.03 mol%。這是迄今為止,首次以葡萄糖和丙酸為碳源合成含有奇數(shù)鏈和偶數(shù)鏈單體的mcl-PHA的報(bào)道。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫素琴,周群,候偉俊,吳瓊,陳國強(qiáng);紅外光譜法動(dòng)態(tài)跟蹤聚羥基脂肪酸酯(PHAs)的熱變性過程[J];光譜學(xué)與光譜分析;2000年05期

本文編號(hào)：2771341