發(fā)布時(shí)間：2020-07-13 01:17

【摘要】：研究背景糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation endoproducts,AGEs)在糖尿病多種血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。病理濃度的AGEs通過(guò)激活氧化應(yīng)激,誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成,從而破壞內(nèi)皮細(xì)胞功能,進(jìn)而在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。新型降糖藥胰高血糖素樣肽1(Glucagon like Peptide-1,GLP-1)可通過(guò)降低血糖,改善微環(huán)境而間接保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞,也可通過(guò)受體或非受體依賴(lài)性途徑直接改善內(nèi)皮功能,抑制動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)的發(fā)生、發(fā)展。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)GLP-1通過(guò)降低內(nèi)皮細(xì)胞的纖溶酶原激活物抑制因子1(Plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)、血管粘附分子(Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1, Vascular cell adhesion molecule, VCAM-1)的水平,減少高凝狀態(tài)和炎癥反應(yīng)對(duì)內(nèi)皮的損傷。此外,研究還發(fā)現(xiàn)GLP-1呈劑量依賴(lài)性降低AGEs誘導(dǎo)下內(nèi)皮細(xì)胞的ROS水平；蛋白激酶A-內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Protein kinase A-Endothelial nitric oxide synthase, PKA-eNOS)信號(hào)通道是GLP-1抑制AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的重要作用機(jī)制之一；GLP-1還可通過(guò)環(huán)磷酸腺苷／蛋白激酶A (Cyclic Adenosine monophosphate/Protein kinase Asystem,cAMP/PKA)信號(hào)途徑減少煙酰胺腺嘌呤二核苷酸酸(Triphosphopyridine nucleotide,NADPH)合成,從而降低腎血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷。研究目的建立AGEs誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)模型,探討GLP-1是否具有拮抗AGEs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用,并探討GLP-1是否可通過(guò)NADPH-、PKA-eNOS信號(hào)途徑發(fā)揮抗氧化、抗凋亡及抗線粒體損傷的作用。研究方法1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的分離、培養(yǎng)及鑒定。標(biāo)本均來(lái)源于廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科正常足月妊娠新生兒臍帶經(jīng)消毒、沖洗、0.1%的I型膠原酶消化、收集等步驟得到分離的細(xì)胞。分離后接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶,置于37℃、5%二氧化碳(Carbon dioxide, CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%以上時(shí),進(jìn)行消化傳代,取生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞用于鑒定。使用免疫熒光法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物第Ⅷ因子相關(guān)抗原(Von Willebrand factor, vWF).2.建立AGEs誘導(dǎo)的HUVECs氧化損傷模型,探討AGEs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)與D-葡萄糖溶于PBS中,避光孵育12周制備AGES。熒光分光光度計(jì)鑒定AGEs。以同樣條件下不含糖的BSA溶液孵育12周后制備的溶液作為本實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)分為：空白對(duì)照組、AGEs (100、200、400、600、800 ug/mL)組,以上6組作用HUVECs24 h(該部分結(jié)果將確定AGEs作用濃度,之后本論文的AGEs及BSA濃度不再特別說(shuō)明,均采用該濃度)；以上確定作用濃度的AGEs分別作用HUVECs 12、24、36、48 h,另設(shè)一空白對(duì)照組。每孔加入10μM二氯熒光黃雙乙酸鹽(Dichlorofluorescein diace-tate,DCFH-DA),經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。確定BSA及AGEs作用濃度及時(shí)間后,實(shí)驗(yàn)分為：空白組、BSA組、AGEs組。配置四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3 '-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide, JC-1)工作液后與HUVECs共孵育,經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的變化。按磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋V/碘化丙啶(Annexin V/Propidium iodide, Annexin V/PI)凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)要求處理細(xì)胞后,經(jīng)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。3.煙酰胺腺嘌呤二核苷酸酸氧化酶4 (Triphopyridine nucleotideoxidase 4, NOX4)在GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用�？瞻讓�(duì)照組、BSA組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組,通過(guò)蛋白印跡法(Western Blotting法)檢測(cè)NOX4蛋白表達(dá)。GLP-1預(yù)處理細(xì)胞30 min后再加入AGEs, GLP-1濃度采用100 nM。(本課題前期研究顯示,該濃度下GLP-1可顯著抑制AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。)(以下部分均按該順序操作,不再贅述。)空白對(duì)照組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription PC, RT-PCR)檢測(cè)HUVECs的NOX4信使核糖核酸(Messenger RNA, mRNA)表達(dá)。空白對(duì)照組、AGEs組、AGEs+陰性對(duì)照siRNA組、AGEs+NOX4siRNA組,檢測(cè)NOX4表達(dá)抑制前后,HUVECs的細(xì)胞凋亡率、ROS及線粒體膜電位水平。采用lipo-2000進(jìn)行NOX4干擾性小核糖核酸(Small interfering RNA, siRNA)轉(zhuǎn)染,陰性干擾組采用亂序的siRNA為錯(cuò)配對(duì)照組,應(yīng)用RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果。4.蛋白激酶A-(Protein kinase A, PKA-)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶-(Endothelial nitric oxide synthase, eNOS-)在GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用空白對(duì)照組、BSA組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組分別檢測(cè)PKA蛋白表達(dá)�？瞻讓�(duì)照組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組、AGEs+GLP-1+PKA抑制劑組,檢測(cè)細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)、ROS生成水平及細(xì)胞凋亡率空白對(duì)照組、BSA組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組、AGEs+GLP-1+eNOS抑制劑組,檢測(cè)細(xì)胞一氧化氮(Ntrogen monoxide, NO)生成水平及細(xì)胞凋亡率。抑制劑預(yù)處理細(xì)胞1h后,加入(或不加)GLP-1 100 nM干預(yù)30 min,最后加AGES。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,統(tǒng)計(jì)方法采用單向方差分析(One-Way ANOVA),其中兩兩比較采用LSD法,相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析法,P0.050為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.充分掌握好消化時(shí)間,可得到純度較高的HUVECs。2.當(dāng)AGEs作用濃度達(dá)400 ug/mL時(shí),細(xì)胞ROS含量熒光值達(dá)到最大,當(dāng)AGEs作用24 h后,細(xì)胞ROS含量熒光值達(dá)到最大。3.GLP-1抑制AGEs誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。與空白組相比,BSA不影響內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成(P=0.996),AGEs處理組較空白組ROS生成明顯增多(P=0.007),而GLP-1與AGEs共孵育組較AGEs單獨(dú)處理組的ROS熒光強(qiáng)度明顯減弱(P=0.010)。對(duì)AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及細(xì)胞線粒體膜電位下降,加入GLP-1后可顯著降低細(xì)胞凋亡率(P=0.000),升高線粒體膜電位(P=0.014)。4.NOX4在GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。AGEs促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞NOX4基因表達(dá)及其蛋白的合成,與空白對(duì)照組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.000和0.001)；在AGEs組加入GLP-1后,可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞NOX4基因的表達(dá)及蛋白合成,與AGEs組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.000和0.003)。在AGEs誘導(dǎo)下,抑制NOX4mRNA表達(dá)后,內(nèi)皮細(xì)胞ROS含量熒光值顯著降低,與單純AGEs處理組及AGEs+陰性干擾組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.011和0.010)。干擾NOX4mRNA基因表達(dá)可顯著拮抗AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位下降(P值分別為0.000和0.017),而予以非NOX4siRNA的小干擾處理則不影響細(xì)胞凋亡率及線粒體膜電位(P值分別為0.169和0.741)。5.PKA-在GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。與空白對(duì)照組相比,BSA并不影響內(nèi)皮細(xì)胞PKA蛋白表達(dá)(P=0.186),而AGEs可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的PKA蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P=0.003)；與AGEs單獨(dú)處理組相比,加入GLP-1共孵育后,AGEs誘導(dǎo)的PKA蛋白較AGEs組顯著上調(diào)(P=0.003)。AGEs組加入GLP-1后,其ROS含量熒光值較單純AGEs組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)；AGEs+GLP-1組加入PKA抑制劑H-89·2HCl后,細(xì)胞ROS含量較加入H-89·2HCl前升高(P=0.045),即抑制PKA蛋白表達(dá)后可部分拮抗GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成的抑制作用。GLP-1與AGEs共孵育組的細(xì)胞凋亡率顯著低于AGEs組(P=0.001); PKA抑制劑H-89·2HCl可顯著拮抗GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抑制作用(P=0.010)。GLP-1與AGEs共孵育組的細(xì)胞線粒體膜電位顯著高于AGEs組(P=0.011)；加入PKA抑制劑H-89·2HCl后,與AGEs+GLP-1組相比,細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低(P=0.021)6. eNOS-在GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。與空白組相比,AGEs可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P=0.004)；在AGEs中加入GLP-1后,可使受抑制的eNOS蛋白表達(dá)再次上調(diào)(P=0.035)；AGEs組予以H-89-2HCl干預(yù)后,AGEs對(duì)eNOS蛋白表達(dá)的抑制作用無(wú)明顯改變(P=0.908)；而AGEs+GLP-1組予以H-89·2HCl干預(yù)后,細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)受抑制(P=0.045)。eNOS抑制劑L-NAME干預(yù)前,AGEs+GLP-1組較AGEs組NO水平顯著升高(P=0.017),細(xì)胞凋亡率顯著降低(P=0.000)。L-NAME干預(yù)后,AGEs+GLP-1組NO生成明顯受抑制(P=0.017),且細(xì)胞凋亡率增加(P=0.011)。結(jié)論1.成功建立一種能大量分離HUVECs的體外培養(yǎng)方法。2.GLP-1可通過(guò)抑制NOX4或激活PKA信號(hào)通道,拮抗AGEs誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激及線粒體損傷,從而發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。3.在AGEs誘導(dǎo)的HUVECs損傷中,GLP-1可通過(guò)PKA-eNOS-NO信號(hào)通道發(fā)揮保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2
【圖文】：

檢測(cè)結(jié)果表明，原代及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，整個(gè)細(xì)胞輪廓清楚，胞漿中可見(jiàn)逡逑黃緣色的巧光著色，胞核呈黑綠色，證實(shí)細(xì)胞內(nèi)有內(nèi)皮細(xì)胞特有的ｖＷＦ相關(guān)抗逡逑原存在（如圖１－２），用ＰＢＳ代替一抗的對(duì)照組為陰性反應(yīng)。。逡逑S/逡逑圖１－２．觀察Y>光顯微鏡下原代人胳靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)（Ｘ２００）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２．邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｈｕｍａｎ邋ｕｎｂｉｌｉｃａｌ邋ｖｅｉｎ邋ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ（ＨＵＶＥＣｓ）邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ逡逑幻邋ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（邋Ｘ邋２００邋）逡逑１．３邋ｉ寸論逡逑ＨＵＶＥＣｓ與動(dòng)物細(xì)胞相比，具備人體生理特性；與動(dòng)化內(nèi)皮細(xì)胞相比Ｗ，取逡逑材更加經(jīng)濟(jì)方便、操作簡(jiǎn)單，且具有與動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特征相似的優(yōu)點(diǎn)Ｗ。逡逑目前市場(chǎng)上所銷(xiāo)售的ＨＵＶＥＣｓ細(xì)胞株都存在一些問(wèn)題，而且，隨著傳代次數(shù)的逡逑增加，細(xì)胞問(wèn)的相互作用及受外界環(huán)境的影響也增加，細(xì)胞的生物學(xué)巧性會(huì)發(fā)逡逑生一定的改變Ｗ，因此原代細(xì)胞顯得更加適合。原代ＨＵＶＥＣｓ在疾病和血管功逡逑能研究中，得到了越來(lái)越多的晚用體外培養(yǎng)的優(yōu)良原代細(xì)胞至少可傳代６逡逑次Ｗ上，用此原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果更加可靠。本實(shí)驗(yàn)方法可分離得到大量逡逑內(nèi)皮細(xì)胞

－圖３－１－２．邋ＧＬＰ－１對(duì)ＡＧＥｓ誘導(dǎo)細(xì)胞Ｎ０Ｘ４表達(dá)的影響。＊；與空Ａ組比較，b6＜０．０５；邋＃；與逡逑ＡＧＥｓ中獨(dú)處理織比較，尸＜０．０５。逡逑Ｉ＾ｉｇｕｒｅ邋３－１－２．Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ＧＬＰ－１邋ｏｎ邋化ｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｎ０Ｘ４邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ＡＧＥｓ．＊邋ＶＳ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｇｒｏｕｐb6＜０．０５；冉邋ｖｓ．邋ＡＧＥｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｇｒｏｕｐb6＜０．０５．逡逑３N２．２．２邋ＧＬＰ－ｌ對(duì)ＡＧＥｓ誘導(dǎo)ＨＵＶＥＣｓ邋ＮＯＸ４基因表達(dá)的影響逡逑

第三■章ＧＬＰ－１對(duì)ＡＧＥＳ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制表３－１－５．Ｍ９NB／ｍＲＮＡ相對(duì)表達(dá)景（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）逡逑Ｔａｂｌｅ３－１－５．Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｎ０Ｘ４ｔｘ＼ＲＮＡ（ｘ邋±邋ｓ）逡逑ｇｒｏｕｐ邐打邐Ｍ）斯ｍＲＮＡ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋Ｆ邐b6逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邐３邐０．０００６７±０．0００２０逡逑ＡＧＥＳ邐３邐０．００３８２±０．０００２５＊邐２４４．７４８邐０．００ＧＬＰ－１邐３邐０．０００３９±０．００００２逡逑ＡＧＥｓ＋ＧＬＰ－１邐３邐０．０００８４±０．０００１３＃逡逑注：＊與空ｎ紐比較，b6＜０．０５；邋＃與ＡＧＥｓ＂單獨(dú)處理紐比較，尸＜０．０５。逡逑

本文編號(hào)：2752745