【摘要】：目的:探討青少期慢性應激對不同性別大鼠行為學、海馬神經(jīng)元、外周免疫及中樞免疫的影響,及四逆散的干預機制。方法:4周齡Wistar大鼠雌雄各半,按體重隨機分為空白組不接受應激,應激組接受為期 21d 的慢性不可預見性應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS),然后應激組再次按體重隨機分為模型組、四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組,繼續(xù)予以CUMS法應激,同時各給藥組給予相應藥物水溶液灌胃,空白組和模型組予生理鹽水灌胃,持續(xù)21d。末次給藥后對各組大鼠檢測體重、糖水偏好率、曠場實驗;采用蘇木精一伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE染色法)觀察各組大鼠海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)區(qū)神經(jīng)元形態(tài);采用默克密理博多因子檢測技術(milliplex map)測定血漿和海馬促炎性細胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白介素 1 β(interleukin 1 β,IL-1 β)、白介素 6(interleukin 6,IL-6)、干擾素γ(interferon γ,IFNγ)和抗炎性細胞因子白介素4(interleukin 4,IL-4)、白介素 10(interleukin 10,IL-10)的濃度;使用 Western-blotting技術檢測海馬小膠質細胞活化標志物CD1 lb及星形膠質細胞活化特征性標記物膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),以及海馬核轉錄因子κB p65(nuclear factor κ B p65,NF-κ B p65)和磷酸化核轉錄因子κBp65(Phospho-NF-κ B p65);用免疫組織化學方法觀察各組大鼠海馬DG區(qū)GFAP表達分布和NF-κ B p65表達分布。當不同性別同組數(shù)據(jù)資料相近并且組間變化趨勢相同時,合并進行統(tǒng)計分析,否則分別按不同性別進行統(tǒng)計分析。結果:一、四逆散對青少期慢性應激大鼠行為學的影響(一)一般狀態(tài)接受應激前,空白組和應激組大鼠都精神狀態(tài)良好,毛發(fā)整潔光亮,活潑好動,飲食正常。初次應激21d后,應激組大鼠表現(xiàn)出精神緊張,飲食量減少,毛發(fā)凌亂、枯黃失澤,灌胃和應激時反應劇烈,易驚并出現(xiàn)弓背防御狀態(tài),易激惹。再次應激21d后,模型組大鼠精神萎靡,體型瘦削,毛發(fā)凌亂色暗,易于脫落,時常蜷伏角落貼籠壁;四逆散低劑量組、四逆散高劑量組和氟西汀組大鼠均表現(xiàn)活躍,鼠毛整潔有光澤。空白組大鼠各方面狀態(tài)保持良好。(二)體重雄鼠模型組較空白組體重顯著降低(P0.05),模型組與四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組體重比較,均無顯著差異(P0.05)。雌鼠模型組較空白組體重顯著降低(P0.05),模型組與四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組體重比較,均無顯著差異(P0.05)。(三)糖水偏好實驗各組糖水偏好率比較無顯著差異(P0.05)。(四)曠場實驗模型組較空白組曠場總路程顯著下降(P0.05),四逆散低劑量組和氟西汀組均較模型組曠場總路程顯著升高(P0.05),四逆散高劑量組較模型組曠場總路程升高,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。二、四逆散對青少期慢性應激大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學的影響海馬DG區(qū)HE染色結果雌雄空白組大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元形態(tài)清晰,結構正常,排列整齊,層次緊密,細胞核清晰,核仁明顯。雄鼠模型組、四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組分別與空白組比較,無明顯差異。雌鼠模型組神經(jīng)元數(shù)量減少,排列疏松,細胞層變薄;雌鼠四逆散低劑量組、四逆散高劑量組和氟西汀組均較MC組改善,排列緊密,細胞層數(shù)增加。三、四逆散對青少期慢性應激大鼠外周免疫炎癥的影響(一)血漿TNF-α 雄鼠各組血漿TNF-α濃度比較無顯著差異(P0.05)。雌鼠模型組較空白組血漿TNF-α濃度顯著降低(P0.05),四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組分別較模型組血漿TNF-α濃度顯著升高(P0.05)。(二)血漿IL-Iβ 各組大鼠血漿IL-Iβ濃度比較均無顯著差異(P0.05)。(三)血漿IL-6、IFN γ、IL-4和IL-10因表達水平較低,應用此方法基本檢測不到。四、四逆散對青少期慢性應激大鼠海馬免疫炎癥的影響(一)海馬TNF-α 雄鼠模型組較空白組海馬TNF-α濃度顯著降低(p0.05),模型組與四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組海馬TNF-α濃度比較無顯著差異(P0.05)。雌鼠各組海馬TNF-α濃度比較無顯著差異(P0.05)。(二)海馬IL-1β 雄鼠模型組較空白組海馬IL-1β濃度顯著升高(P0.05),四逆散低劑量組、四逆散高劑量組均較模型組海馬IL-1β濃度顯著降低(P0.05),氟西汀組較模型組海馬IL-1β降低,但差異無顯著性(P0.05)。雌鼠各組海馬IL-1β濃度比較無顯著差異(P0.05)。(三)海馬IL-6模型組較空白組海馬IL-6濃度顯著升高(P0.05),四逆散低劑量組、四逆散高劑量組均較模型組海馬IL-6濃度顯著降低(P0.05),氟西汀組較模型組海馬IL-6濃度降低,但差異無顯著性(P0.05)。(四)海馬IFNγ 模型組較空白組海馬IFN γ濃度顯著升高(P0.05),四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組均較模型組海馬IFNγ濃度顯著降低(P0.05)。(五)海馬IL-4模型組較空白組海馬IL-4濃度顯著降低(P0.05),四逆散低劑量組較模型組海馬IL-4濃度顯著升高(P0.05),四逆散高劑量組、氟西汀組均較模型組海馬IL-4濃度升高,但差異無顯著性(P0.05)。(六)海馬IL-10雄鼠模型組較空白組海馬IL-10濃度顯著升高(P0.05),四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組均較模型組海馬IL-10濃度顯著降低(P0.05)。雌鼠各組海馬IL-10濃度比較無顯著差異(P0.05)。(七)海馬CD11b相對蛋白量雄鼠各組海馬CD11b相對蛋白量比較無顯著差異(P0.05)。雌鼠模型組較空白組海馬CD11b相對蛋白量顯著降低(P0.05),四逆散低劑量組、四逆散高劑量組均較模型組海馬CD11b相對蛋白量顯著升高(P0.05),氟西汀組與模型組海馬CD11b相對蛋白量無顯著差異(P0.05)。(八)1.海馬GFAP相對蛋白量雄鼠模型組較空白組海馬GFAP相對蛋白量顯著降低(P0.05),模型組與四逆散低劑量組、四逆散高劑量、氟西汀組海馬GFAP相對蛋白量比較均無顯著差異(P0.05)。雌鼠模型組較空白組海馬GFAP相對蛋白量顯著升高(P0.05),四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組均較模型組海馬GFAP相對蛋白量顯著降低(P0.05)。2.海馬DG區(qū)GFAP免疫組化結果鏡下可見GFAP在各組大鼠海馬DG區(qū)均有表達,主要分布在膠質細胞胞漿及突起,呈棕黃色,星形膠質細胞形態(tài)呈星形或放射狀。雄鼠空白組大鼠海馬DG區(qū)呈均勻彌漫性染色,有長短不等而粗壯的突起。模型組大鼠海馬DG區(qū)內GFAP表達下降,陽性細胞數(shù)量減少,分布稀疏,突起變短細、染色變淺。四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組分別與模型組相比較,無明顯差異。雌鼠空白組大鼠海馬DG區(qū)內GFAP免疫陽性細胞胞體較小,突起纖細。模型組大鼠海馬DG區(qū)內GFAP表達明顯增多,著色密集,陽性的星形膠質細胞突起增粗且分支增多、變長、深染。四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組海馬DG區(qū)星形膠質細胞增生程度均較模型組明顯改善。(九)1.海馬NF-κ B p65相對蛋白量各組海馬NF-κ B p65相對蛋白量比較無顯著差異(P0.05)。2.海馬DG區(qū)NF-κ B p65免疫組化結果鏡下可見NF-κ B p65在各組大鼠海馬DG區(qū)均有表達,呈棕黃色著色。雌雄空白組細胞漿都可見NF-κBp65陽性表達,但未見核內NF-κ Bp65陽性表達。雌雄模型組同樣有胞漿NF-κ Bp65陽性表達,而且NF-κ Bp65在一部分細胞核內也有陽性表達,可見NF-κ Bp65發(fā)生核移位。與模型組比較,四逆散低劑量組、四逆散高劑量組和氟西汀組NF-κBp65同樣主要是在漿表達,NF-κ Bp65核表達陽性細胞數(shù)較模型組減少,提示能抑制NF-κ Bp65蛋白核移位。(十)海馬Phospho-NF-κ B p65相對蛋白量雄鼠各組海馬Phospho-NF-κ B p65相對蛋白量比較無顯著差異(P0.05)。雌鼠模型組較空白組海馬Phospho-NF-κBp65相對蛋白量顯著升高(P0.05),四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組均較模型組海馬Phospho-NF-κ B p65相對蛋白量顯著降低(P0.05)。結論:(一)單純青少期慢性應激未引起動物抑郁障礙的特征性表現(xiàn),但可出現(xiàn)一定的自主行為異常,并使雌鼠產(chǎn)生神經(jīng)損傷,形成"生物瘢痕",留下潛在的長期的影響。(二)單純青少期慢性應激對中樞免疫的影響比外周免疫顯著。(三)單純青少期慢性應激可引起中樞免疫功能紊亂,包括免疫激活和免疫抑制同時發(fā)生,如小膠質細胞、星形膠質細胞狀態(tài)改變,細胞因子升高或下降,NF-κB通路激活等,具體表現(xiàn)具有性別差異。應激引起的神經(jīng)"生物瘢痕"形成機制與中樞免疫功能紊亂相關。(四)四逆散可同時調節(jié)單純青少期慢性應激引起的免疫激活和免疫抑制,改善免疫紊亂,恢復免疫平衡,改善神經(jīng)元損傷,提示中藥合劑對機體免疫的雙向調節(jié)作用。本研究結果可為四逆散抗應激損傷早期臨床應用提供實驗依據(jù)。創(chuàng)新點:(一)既往研究慢性心理應激影響的動物實驗大多針對成年階段和雄性動物。本研究選取青少期階段為研究對象,對雌雄動物進行研究,發(fā)現(xiàn)青少期慢性應激引起的潛在生物學改變及其性別差異,為精神障礙發(fā)病的預防和及早干預提供了實驗基礎。(二)既往為數(shù)不多的青少期應激研究主要從神經(jīng)發(fā)生或神經(jīng)內分泌的角度探討其中樞病理改變。本研究結合當下研究熱點之一的抑郁炎癥假說,從免疫機制的角度,探討青少期應激導致的免疫紊亂,尤其是中樞的免疫失衡,豐富了青少期應激的研究維度。(三)本研究結果反映出四逆散對青少期慢性應激引起的免疫紊亂能同時發(fā)揮相應的雙向調節(jié)作用,為四逆散抗應激損傷早期臨床應用提供了實驗依據(jù)。
【圖文】：

炎癥假說認為：＂應激能夠激活機體免疫系統(tǒng)，增加細胞因子釋放，進一步影響神經(jīng)逡逑遞質合成、釋放與代謝，改變神經(jīng)可塑性Ｌ義及神經(jīng)內分泌功能，最終引發(fā)抑郁癥。＂（見逡逑圖１）逡逑Ｒｄｕｃｅｄ逡逑ＴＴＴ￣ｎ邐ｒ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ逡逑Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ｏｆ邐邐邋：：：：：：：：．．．：：：：：：．＂：．：：：＇：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：逡逑ｔｈｅ邋ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ邐ＪＮｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔａｆｓｌ－＾，腳產(chǎn)扣逡逑ｉｍ邋巧肌邋６邐＾＾邐ｍｅｔａｂｄ邋反邋ｍ逡逑ｓｙｓｔＯＴ邐Ｉ賊微}0逡逑ｎｅｉ＾ｔａｋｅ逡逑ｉ＼邐Ｏｖｅｒ－逡逑邐邐ｉ邋Ｃｙｔｏｋｉｎｅ邋邐邋ｘｌｉｖａｌｉｏｎ邋邐逡逑Ｓｔｒｅｓｓ邋－？邐Ｉ邋邐？－邋ＨＰＡａｘｉｓ邋—邋＇邋0＾＾ｅｄ邋１邋Ｄｅｐｒ＾ｓｉｏｎ逡逑＼邋ｉ邐Ｌ邋ｎ邋卿邋ｖ０逡逑＾＾邐ｆｅ＾ａｃＮ邐Ｉ逡逑ＡｃＢｖｓｔｉＱｎ邋ｃｆ逡逑ｔｈｅ邋ｃｅｎｔｒａｌ逡逑耐巧狐ｓ邐Ｉ邐１邋ｒ邋Ｒｅｄｕｃｅｄ邋Ｉ逡逑Ｉ邋ｓ品邐ｙ}瑁餡ｙｈＵ巧斯泌ｉｓＰ逡逑圖１抑郁炎癥假說。逡逑一、抑郁癥與免疫炎癥途徑逡逑臨床證據(jù)顯示，不管抑郁癥患者是否有基礎疾病，其外周血液及腦脊液的炎癥細逡逑胞因子水平與非抑郁癥患者比較均升高Ｗ。Ｓｃｈｍｉｄｔ等研巧發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者較正常對逡逑照炎癥細胞因子表達水平更高ＵＷ。Ｊｏｈａｎ等人對抑郁癥患者進行１２周的隨訪發(fā)現(xiàn)，抑逡逑郁癥患者在發(fā)抑郁階段，其血漿中檢測到有多種細胞因子水平升高，，而經(jīng)過治療抑郁逡逑癥狀完全緩解時的細胞因子水平降到正常水平Ｗ。黃茹燕等發(fā)現(xiàn)

有受虐待經(jīng)歷的抑郁癥患者較那些無受虐待經(jīng)歷的患者炎癥變化更嚴重＂＂。實驗研究逡逑中長期處于應激狀態(tài)的大鼠，ＩＬ－１水平增高。應激－免疫相互作用和抑郁癥之間的關逡逑系見圖２。逡逑６逡逑
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2582970