本文關鍵詞：SIRT3對小鼠心肌肥厚中線粒體脂質代謝障礙及纖維化的影響及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景左室心肌肥厚(left ventricular hypertrophy, LVH)是心臟對于壓力或容量超負荷、肌節(jié)蛋白基因突變或心肌梗死導致收縮力下降等病理情況的適應性反應,其伴隨著多種心臟疾病,如高血壓、瓣膜病及缺血性心臟病。在這些疾病的病理過程中,壓力負荷過重會導致向心性心肌肥厚,而向心性心肌肥厚被認為是一種具有代償作用的病理改變因其可以增加左室收縮力、降低室壁壓力和心肌耗氧量。然而,左室心肌肥厚同樣可以成為嚴重心力衰竭以及惡性心律失常的危險因素。因此,在不引起循環(huán)功能障礙的前提條件下有效的抑制左室心肌肥厚被認為具有重要的臨床意義。在尋求抑制左室心肌肥厚方法的過程中,很重要的一點是明確心肌肥厚中不利于其適應性反應的機制。在眾多心肌肥厚所帶來的不利因素中,能量代謝異常顯得尤為突出：在左室心肌肥厚的條件下,心臟的能量代謝方式由主要依靠長鏈脂肪酸有氧氧化轉變?yōu)槠咸烟怯醒跹趸�。能量代謝底物的改變一方面可以減少生成每摩爾ATP所需的耗氧量,即能夠減少細胞內活性氧簇(Reactive Oxygen Species, ROS)的生成；但另一方面,這一改變不可避免的存在著大量的不利因素,如慢性脂肪酸有氧氧化障礙導致心肌細胞內脂質累積、乳酸堆積、以及糖酵解增多所帶來的總ATP水平下降。Van等在于2004年提出心肌代謝重構(metabolic remodeling)的概念,即由心肌細胞在慢性超負荷及底物供應改變時引起的心臟能量代謝途經改變、線粒體功能失調以及高能磷酸鹽代謝異常致使心肌能量產生障礙、導致結構和功能異常的現(xiàn)象。但是目前關于左室心肌肥厚過程中脂質代謝障礙的分子學機制尚未清楚。Sirtuins(SIRTs)是一類依賴NAD+輔酶的去乙�；�,包含7個不同的亞型。由Shore等于1984年首次在酵母菌中發(fā)現(xiàn),隨后SIRTs被發(fā)現(xiàn)可以調節(jié)酵母菌的壽限,2000年Imai等發(fā)現(xiàn)其具有依賴NAD+輔酶的去乙酰化活性并且可以調節(jié)細胞的代謝狀態(tài)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)SIRTs延長壽限的作用機制與熱量攝入限制(calorie restriction, CR)類似,提示其對細胞能量代謝的調節(jié)作用可能在這一過程種發(fā)揮重要作用。由于SIRTs的活性依賴于細胞內NAD+輔酶的水平,且細胞內NAD+輔酶的水平主要由細胞內能量代謝狀態(tài)決定,因此,SIRTs對于細胞內感知能量代謝的轉導通路具有重要的調節(jié)作用。最近許多研究發(fā)現(xiàn),SIRTs調控許多關鍵細胞進程,如胰島素分泌、細胞周期以及細胞凋亡。目前已經有研究證明SIRTs是治療代謝紊亂及代謝相關疾病的藥物治療靶點。在已發(fā)現(xiàn)的七個SIRT蛋白中,SIRT3是唯一一個被證明其表達水平與人類壽命長度相關的分子。目前,已有研究表明SIRT3具有易化脂類、氨基酸及碳水化合物代謝的作用。且許多研究發(fā)現(xiàn)SIRT3可以通過降低細胞內ROS水平發(fā)揮心肌細胞保護作用。SIRT3可以去乙酰化多種線粒體內代謝關鍵酶,如乙酰輔酶A合成酶2 (acetyl-CoA-synthetase 2, AceCS2)長鏈脂酰輔酶A脫氫酶(Long-chain acyl CoA dehydrogenase, LCAD),琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase),異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase),并使這些代謝酶活性升高。其中,LCAD是一個脂肪酸有氧氧化過程中的關鍵酶,但是目前關于SIRT3是否能通過影響LCAD活性從而發(fā)揮降低心肌肥厚脂質累積的作用尚不清楚。研究目的：1.探討SIRT3在心肌肥厚中是否具有保護作用。2.探討SIRT3對心肌肥厚中線粒體脂質代謝的影響。3.研究過表達SIRT3是否能夠減輕肥厚心肌細胞中脂質累積。研究方法：1.實驗動物：所有動物實驗均符合國家衛(wèi)生部動物管理辦法(文案號No.55,2001)和山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會對動物實驗的要求和規(guī)定。SIRT3-KO小鼠購自美國Jackson實驗室,6-7周齡雄性129野生型小鼠購自北京大學動物研究所。2.構建小鼠心肌肥厚模型：我們給予8周齡雄性小鼠(年齡匹配的野生型小鼠和SIRT3-KO小鼠)以胸主動脈縮窄術(TAC)。我們采用戊巴比妥鈉對動物進行麻醉,將胸主動脈從周圍組織中分離出來,于兩側頸總動脈之間放置27號空針針頭(27-gauge needle)然后進行手術縫線結扎,迅速將針頭移除。除結扎外,假手術組動物被給予相同處理。所有動物在術后6周處死,將小鼠心臟取材進行肥厚指標和脂質分析等方面的研究。3.免疫組織化學：取材后,組織切片進行HE染色觀察形態(tài),進行Masson染色來評估膠原含量。膠原含量采用自動圖像分析軟件(Image Pro Plus)進行定量分析。4.超聲心動圖：采用VisualSonics Vevo 770小動物超聲進行左室長軸測量,分別采用M-mode、二維超聲心動圖(2-D)、脈沖多普勒超聲(Pulse Wave Doppler, PWD)等模式進行圖形采集并分析。5.透射電子顯微分析：利用透射電子顯微鏡(TEM, H-7000FA, Hitachi, Tokyo, Japan)對心肌組織超微結構進行觀察分析,放大倍數(shù)為15000倍。6.甘油三酯和膽固醇含量分析：心肌組織中的甘油三酯(TG)和膽固醇(cholesterol)采用氯仿、甲醇混合液提取,然后分別采用定量試劑盒進行分析(Biovision Inc)7.離體Langendorff灌流和棕櫚酸酯氧化率測定：離體心臟在37℃溫箱中進行Langendorff體外灌流(95% 02,5%C02),灌流壓力設置為1OOmmHg。經過15分鐘的穩(wěn)定期,灌流液置換為含1mM3H標記的棕櫚酰酯的緩沖液,放射量為0.2μCi ml-1,灌流持續(xù)1小時。通過在上清液中檢測棕櫚酰酯氧化生成的3H2O線性增長速度來評價棕櫚酸酯氧化率,棕櫚酰酯氧化率單位以μmol/g/min表示。8.細胞培養(yǎng)、轉染及處理：大鼠肌母細胞系H9C2 (cardiac myoblast)購于ATCC,于含5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)。所有病毒轉染實驗使用感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為10的病毒量進行轉染。應用去氧腎上腺素注射液(PE,20μm)刺激H9C2細胞系48小時構建體外心肌細胞肥厚模型。9.細胞內油紅0染色及膽固醇、甘油三酯定量分析：用10%的多聚甲醛固定細胞90分鐘,隨后在油紅O染液中孵育3小時后于顯微鏡下觀察細胞內脂質累積情況；細胞內膽固醇和甘油三酯定量分析采用酶比色試劑盒(Wako)進行測定。10.蛋白質免疫印跡：將凍存的心肌組織和處理的細胞用裂解液裂解,提取總蛋白,SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品,濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上,封閉后用特異性一抗4℃孵育過夜,然后二抗室溫2小時。ECL化學發(fā)光液顯影目的蛋白條帶,LAS-4000化學發(fā)光儀檢測。11.統(tǒng)計學分析：定量數(shù)據均以均數(shù)±標準差表示,兩組之間比較采用獨立樣本的t檢驗；多組之間比較采用one-way ANOVA檢驗及q檢驗。設P0.05為有統(tǒng)計學意義。研究結果：1.SIRT3在小鼠肥厚心肌中表達降低我們給予小鼠TAC術,并觀察6周。為確保主動脈結扎成功,我們利用超聲心動圖探查主動脈結扎部位并測量其血流速度。我們通過計算小鼠心重與體重比值,發(fā)現(xiàn)小鼠心臟在結扎2周、4周、6周后分別產生20%、40%、60%的心肌肥厚。此外,我們發(fā)現(xiàn)與假手術組相比,短片段SIRT3在TAC術后明顯降低；而長片段SIRT3在輕度肥厚時輕度上升,在嚴重肥厚時并無明顯表達變化。這些結果與Sundaresan等在類似心肌肥厚疾病模型中獲得的結論一致,證實了短片段的去乙�；鞍譙IRT3在小鼠肥厚心肌中表達降低。2.SIRT3-KO小鼠在TAC術后易于形成心肌肥厚為進一步研究SIRT3在心肌肥厚中所起的作用,我們給與SIRT3-KO小鼠及野生型小鼠TAC術。我們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比,SIRT3-KO小鼠TAC術后肥厚程度更加嚴重(15%)。在假手術組,SIRT3-KO小鼠亦出現(xiàn)比野生型小鼠更高的心重體重比。組織學檢查顯示,無論在TAC還是假手術組,SIRT3-KO小鼠心肌中表現(xiàn)出更加嚴重的細胞壞死和心肌纖維化。我們利用超聲心動圖對小鼠心臟進行無創(chuàng)評價：SIRT3-KO小鼠左室后壁在基礎水平及TAC術后均較野生型小鼠更厚。此外,左室短軸縮短率(Fraction Shortening, FS)分析顯示SIRT3-KO小鼠更加容易形成嚴重收縮功能障礙。這些研究發(fā)現(xiàn)SIRT3-KO小鼠在TAC術后易于出現(xiàn)心臟功能受損及心力衰竭,提示SIRT3在心肌肥厚的過程中發(fā)揮重要作用。3.SIRT3-KO小鼠心肌中出現(xiàn)過度脂質積累及脂肪酸氧化速率降低我們利用透射電子顯微鏡觀察小鼠肥厚心肌,結果顯示肥厚心肌中線粒體形態(tài)出現(xiàn)嚴重病變。SIRT3-KO在正常情況下未表現(xiàn)出明顯的心肌表型變化；野生型和SIRT3-KO小鼠在TAC術后出現(xiàn)明顯的脂質累積；但是與野生型小鼠相比,SIRT3-KO小鼠出現(xiàn)更明顯的線粒體腫脹,線粒體嵴紊亂以及線粒體內出現(xiàn)大量的泡沫。我們運用其他代謝學檢測方法對小鼠心肌檢查后發(fā)現(xiàn),甘油三酯及膽固醇水平在TAC術后均升高,在SIRT3-KO、鼠心肌中甘油三酯升高的更加明顯,提示心肌細胞脂肪酸氧化功能受損,同時驗證了電鏡掃描結果。為了直接評估脂肪酸氧化能力,我們利用棕櫚酸氧化率進行測算。在野生型小鼠中,棕櫚酸氧化率降低30%,而在SIRT3-KO、鼠中,棕櫚酸氧化率在正常和肥厚狀態(tài)下均明顯降低�？傊�,結果顯示SIRT3-KO小鼠在心肌肥厚刺激后出現(xiàn)過度脂質累積和脂肪酸氧化率降低。4.SIRT3調控LCAD的乙酰化狀態(tài)心肌細胞內催化脂肪酸氧化的代謝酶均位于線粒體內,所以我們進一步探討短片段的去乙�；鞍酌窼IRT3是否參與脂肪酸氧化的調節(jié)。結果顯示SIRT3-KO小鼠的線粒體蛋白出現(xiàn)明顯的過度乙�；辉谝吧托∈笾�,線粒體蛋白出現(xiàn)明顯的過度乙�；野殡S著短片段SIRT3的降低。我們利用抗乙�；嚢彼峥贵w與內源性的線粒體蛋白進行免疫共沉淀,然后用抗LCAD抗體進行蛋白印跡實驗,結果顯示LCAD在正常狀態(tài)下可以被乙�；揎�,在心肌肥厚狀態(tài)下呈現(xiàn)過度乙酰化狀態(tài)。當我們對SIRT3-KO小鼠進行同樣實驗后發(fā)現(xiàn),LCAD在正常和肥厚兩種狀態(tài)下均顯示出明顯的過度乙�；癄顟B(tài)。這些結果顯示出SIRT3對于去乙酰化SIRT3具有必要作用。為了進一步證明SIRT3可以直接去乙�；疞CAD,我們將Flag標記的LCAD病毒載體與SIRT3病毒或空載體病毒共轉染小鼠心肌細胞。結果顯示,心肌細胞中過表達SIRT3可以降低LCAD的乙�；潭��？傊�,這些結果顯示去乙酰化蛋白酶SIRT3可能通過調節(jié)心肌細胞線粒體內的LCAD的乙�；癄顟B(tài)從而影響脂肪酸氧化作用。5.過表達SIRT3可以減少脂質累積并抑制心肌肥厚反應心肌細胞先進行SIRT3或空載體病毒轉染48小時,然后利用去氧腎上腺素(phenylephrine, PE,20μM)或空白對照(生理鹽水)刺激心肌細胞。我們發(fā)現(xiàn)過表達SIRT3可以降低心肌肥厚標志物α-SMA的表達；通過3H亮氨酸摻入率實驗我們發(fā)現(xiàn)過表達SIRT3可以降低心肌細胞蛋白合成；同時過表達SlRT3可以降低ANF及β-MHC基因表達。此外,通過油紅O染色實驗,我們還觀察到PE刺激可以是心肌細胞內出現(xiàn)脂滴增多,而過表達SIRT3可以是心肌細胞內脂滴減少。通過脂質定量檢測發(fā)現(xiàn),心肌細胞內膽固醇和甘油三酯在PE刺激后均升高,過表達SIRT3可以使其分別降低40%和50%。這些結果顯示過表達SIRT3可能通過減低細胞內脂質沉積從而降低心肌細胞肥厚反應。結論：1.SIRT3具有減輕心肌肥厚反應的作用。2.SIRT3可以改善心肌肥厚中線粒體脂質代謝障礙。3.SIRT3可以通過調節(jié)LCAD乙�；癄顟B(tài)改善心肌細胞線粒體脂肪酸氧化。研究背景心肌纖維化是一種廣泛存在于多種心臟疾病的病理過程,壓力超負荷性心臟病(如高血壓、主動脈狹窄)因其能夠引起廣泛而嚴重的心肌纖維化越來越受到關注。在動物模型中,壓力負荷過重在早期可引起心肌肥厚,心肌纖維化及舒張功能異常；在晚期則出現(xiàn)心臟功能失代償,具體表現(xiàn)擴張性心肌病變及收縮功能減低。膠原纖維合成和分解方面的紊亂可導致心臟結構和功能的異常。纖維化可以使心臟收縮和舒張期心肌細胞電機械偶聯(lián)功能失調,對心臟收縮和舒張功能產生損害。心肌間質中膠原纖維累積增多可以導致室壁僵硬度增加,使心臟主動舒張功能受損；反之,心肌間質中過度激活的纖維化重構往往涉及到細胞外基質(ECM)降解加強,最終導致心室擴張及收縮功能衰竭。心肌纖維化中膠原網絡功能異常常常通過以下機制導致收縮功能減低：第一,膠原纖維的喪失使心肌纖維收縮協(xié)調性降低,使得心肌細胞收縮無法轉化成正常的心肌收縮力；第二,心肌間質中組成成分的相互作用(如層粘連蛋白,膠原及其受體)對于維持心肌細胞的穩(wěn)態(tài)平衡具有重要作用；第三,心肌纖維化導致心肌細胞被心肌成纖維細胞取代,導致左室擴張。心肌纖維化除了對心臟收縮舒張功能造成巨大影響外,還可通過介導異常折返通路形成從而產生心律失常。SIRT3是一類依賴NAD+的組蛋白去乙�；�,是唯一一個被證實其表達水平與人類壽命長度有關的Sirtuin。有研究表明運動和熱量攝入限制能夠升高SIRT3表達水平。SIRT3在游離脂肪酸氧化功能中發(fā)揮重要作用,對于維持細胞ATP水平具有重要意義。在心臟中,SIRT3具有抵抗氧化應激損傷作用從而保護心肌細胞,抑制心肌肥厚形成。SIRT3能夠通過去乙�；{節(jié)多種代謝酶和轉錄因子的乙酰化狀態(tài)從而影響其活性,參與能量產生,底物代謝,ROS等多種細胞內通路的調節(jié),但是關于SIRT3在心肌纖維化方面的研究較少。如何健康而長壽的生存一直是令人神往的問題,既往研究發(fā)現(xiàn)熱量攝入限制(Calorie restriction, CR)被認為是一條重要的方法。但在現(xiàn)代社會,食物來源過度豐富以及可利用時間大大減少均使得CR成為不太可能實踐的一種方式。盡管接種疫苗、使用抗生素、更好的兒童醫(yī)療保護以及疾病早期診療措施的聯(lián)合應用能夠幫助延長人類的平均壽命,如何能延長人類的最大壽命限度仍然有待研究。在過去20年衰老領域中的研究中,最大的進展是CR有利方面的重大發(fā)現(xiàn)及這些有利方面背后的分子學機制。許多研究提示CR的保護作用依賴于Sirtuins參與。盡管CR對人類健康具有重要的保護作用,這樣一種飲食方式似乎并不可能被廣泛采用和接受,因為CR可能對衰弱、嚴重疾患及老年患者造成重大威脅。因此能夠提供類似CR有利作用且不限制熱量攝入限制的CR模擬物成為研究熱點。白藜蘆醇(Resveratrol, RSV)是首個被發(fā)現(xiàn)的可以通過模擬CR作用從而激活Sirtuin的藥物,小鼠長期接受RSV注射可以引起CR類似的基因表達變化,推遲年齡相關的退化。此外,RSV能夠抑制自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneous Hypertension Rat, SHR)心肌肥厚及纖維化。上述研究提示SIRT3在心肌細胞保護方面具有重要作用,而且熱量攝入限制和Sirtuin激活的有利作用使得Sirtuin的小分子激活劑成為研究的熱點。本研究擬以胸主動脈縮窄術(TAC)構建壓力負荷性小鼠心肌肥厚模型,探討SIRT3在心肌纖維化中的作用機制,并進一步通過體外誘導肌成纖維細胞分化,研究SIRT3在該過程中對纖維化關鍵轉錄因子TGF-β/SMAD的調節(jié)作用,明確其可能的作用機制及信號通路。研究目的：1.探討SIRT3對壓力超負荷引起的心肌纖維化的影響。2.研究白藜蘆醇對小鼠心肌中SIRT3表達水平的影響。3.探討SIRT3激活通過何種途徑減輕心肌纖維化。研究方法：1.實驗動物：所有動物實驗均符合山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會對動物實驗的要求和規(guī)定和國家衛(wèi)生部動物管理辦法(文案號No.55,2001)。6-7周齡雄性129野生型小鼠購自北京大學動物研究所,SIRT3-K 0小鼠購自美國Jackson實驗室。2.動物飲食：我們在實驗中給予動物熱量攝入限制飲食(CR),普通對照飲食(Control Dietary,CD)及白藜蘆醇補充飲食(RSV supplemental, RSV)。根據AIN-93M (BioServ, Frenchtown, NJ)飲食推薦,我們給予CD組小鼠每周86.4 kcal的食物熱量供應,給予CR組小鼠每周64.8 kcal的食物熱量供應。RSV組小鼠給予普通對照飲食加1.8mg/kg/天的含RSV的飼養(yǎng)用水供應。3.構建小鼠心肌纖維化模型：我們采用胸主動脈縮窄術(TAC)建立8周齡雄性小鼠(年齡匹配的野生型小鼠和SIRT3-KO小鼠)反應性心肌纖維化動物模型。我們采用戊巴比妥鈉對動物進行麻醉,將胸主動脈從周圍組織中分離出來,將27號空針針頭(27-gauge needle)放置于兩側頸總動脈之間,然后進行手術縫線結扎,迅速將針頭移除。除結扎外,假手術組動物被給予相同處理。所有動物在術后8周處死,將小鼠心臟取材進行肥厚和纖維化等方面的研究。4.免疫組織化學：取材后,組織切片進行HE染色觀察形態(tài),進行天狼星紅染色來評估膠原含量。膠原含量采用自動圖像分析軟件(Image Pro Plus)進行定量分析。5.超聲心動圖：采用異氟烷吸入麻醉,采用VisualSonics Vevo 770小動物超聲30-Mz進行左室長軸測量,分別采用M-mode、二維超聲心動圖(2-D)、脈沖多普勒超聲(PulseWave Doppler, PWD)等模式進行圖形采集并分析。6.原代心肌成纖維細胞分離和培養(yǎng)：我們提取大鼠乳鼠(1-3d)心臟中心肌成纖維細胞。采用含10%胎牛血清及雙聯(lián)抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌成纖維細胞,將細胞置于含5%C02的37℃孵箱中培養(yǎng)。7.體外誘導肌成纖維細胞分化：采用血管緊張素2(Angll,1 μ mol/L)刺激心肌成纖維細胞,誘導其向心肌成纖維細胞分化。8.細胞免疫熒光：將細胞置于4%多聚甲醛中固定15分鐘,將固定好的細胞置于4℃冰箱,采用1：200稀釋的SMA或Smad3一抗過夜孵育,細胞熒光采用激光共聚焦顯微鏡及軟件進行分析。9.蛋白質免疫印跡：將凍存的心肌組織和處理的細胞用裂解液裂解,提取總蛋白,SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品,濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上,封閉后用特異性一抗4℃孵育過夜,然后二抗室溫2小時。ECL化學發(fā)光液顯影目的蛋白條帶,LAS-4000化學發(fā)光儀檢測。10.實時定量PCR分析：采用Trizol法提取心肌組織及細胞中的RNA,采用逆轉錄PCR法將mRNA逆轉錄為cDNA,使用SYBR green法測定組織和細胞中目的基因的表達量。11.統(tǒng)計學分析：計量資料均以均數(shù)±標準差表示,兩組之間比較采用獨立樣本的t檢驗；多組之間比較采用one-way ANOVA檢驗及q檢驗。設P0.05為有統(tǒng)計學意義。研究結果：1.RSV可升高小鼠心肌SIRT3表達水平我們給予野生型小鼠組熱量攝入限制飲食(CR)和白藜蘆醇補充飲食(RSV)8周,發(fā)現(xiàn)CR組心肌組織內SIRT3表達水平較對照組升高1倍以上(*p0.05)。此外,白藜蘆醇干預(RSV, 1.8 mg·kg-1·day-1)可以引起與CR作用類似的SIRT3表達水平升高。隨后,我們給予野生型小鼠組及SIRT3/-/小鼠組TAC術及假手術組處理(小鼠按不同進食方式進行喂養(yǎng)直至安樂死)。在實驗中我們觀察到SlRT3在TAC術后水平降低50%,而白藜蘆醇干預可維持小鼠心肌內SIRT3的表達水平。2.白藜蘆醇抗心肌肥厚作用依賴于SIRT3參與根據心重/體重比值測量,SIRT3-./-小鼠組在壓力超負荷刺激下產生更加嚴重的心肌肥厚(73%in SIRT3 KO+vehicle+TAC組；32%in WT+vehicle+TAC組,*p0.05),白藜蘆醇干預可減輕野生型小鼠組心肌肥厚狀態(tài),但在SIRT3-/-小鼠組未起到保護作用。白藜蘆醇干預可以降低其他心肌肥厚標志物水平,如ANP,Myh-7,但在SlRT3-/-小鼠組未能降低此類胎性基因表達,上述結果提示白藜蘆醇改善心肌肥厚作用依賴于SIRT3參與。3.白藜蘆醇激活SIRT3可以改善心肌舒縮功能我們對小鼠進行超聲心動圖檢測,結果顯示在壓力超負荷刺激下,SIRT3-/-小鼠組左室后壁厚度較野生型小鼠組更加肥厚(1.45±0.07 mm,*p0.05)。左室短軸縮短率在TAC術后明顯降低,尤其在SⅠRT3-/-組,但左室射血分數(shù)在兩組間無明顯差別。在我們的實驗中我們發(fā)現(xiàn)壓力超負荷容易造成心臟舒張功能異常,其中Aa速度升高及Ea/Aa比值降低均提示舒張功能減低。在我們的研究中發(fā)現(xiàn),SIRT3-/-小鼠組及野生型小鼠組在TAC術后舒張功能均下降,尤其在SIRT3-/-小鼠中更為明顯。白藜蘆醇可以改善野生型小鼠組心臟舒張功能,但在SIRT3-/-小鼠組未起到明顯改善作用。上述研究證實白藜蘆醇激活SIRT3可以改善心肌功能,尤其是舒張功能。4.白藜蘆醇激活SIRT3可以減輕心肌纖維化心肌纖維化心肌重構的一個重要特征。我們對心肌組織進行天狼星紅染色并于偏振光顯微鏡下觀察。在壓力超負荷刺激下,SIRT3-/-小鼠組和野生型小鼠組均較假手術組纖維化水平更高,且SIRT3-/-小鼠可自發(fā)形成心肌纖維化。白藜蘆醇干預可以減輕野生型小鼠心肌纖維化,但在SIRT3-/-小鼠中未觀察到此保護作用,提示白藜蘆醇的抗纖維化作用依賴于SIRT3參與。通過Western blot檢測,心臟中膠原l和膠原Ⅲ在TAC術后表達水平增高。白藜蘆醇可以降低野生型小鼠組肥厚心肌中膠原纖維的累積,但并未降低SIRT3+小鼠中的膠原表達。5.白藜蘆醇激活SIRT3可以抑制促纖維化分子表達TGF-β、α-SMA及TIMP-2是細胞外基質合成和降解的標志物。SIRT3-/-和野生型小鼠組在TAC術后促纖維化因子水平均升高。白藜蘆醇干預可降低野生型小鼠組TGF-β、α-SMA及TIMP-2水平,但是未能降低SlRT3-/-小鼠促纖維化因子表達。TGF-β受體(TRβ1和TRβ2)可以增加SMAD3的磷酸化水平,纖維化中TGF-β通路激活表現(xiàn)在P-SMAD3水平升高。白藜蘆醇干預可以降低TGF-β受體表達水平,降低SMAD3的磷酸化水平,但在SlRT3-/-小鼠中并未觀察到此作用。因此,白藜蘆醇激活SIRT3可以降低促纖維化因子TGF-β、α-SMA及TIMP-2表達水平,并可能通過抑制TGF-β/Smad3通路改善心肌纖維化。6.白藜蘆醇可激活心肌成纖維細胞中SIRT3,并抑制肌成纖維細胞分化我們利用不同濃度的白藜蘆醇(0-100μM)刺激心肌成纖維細胞24h,發(fā)現(xiàn)80μM白藜蘆醇可以將SIRT3表達水平升高2倍以上。隨后,我們用80μM白藜蘆醇刺激心肌成纖維細胞48h,發(fā)現(xiàn)80μM白藜蘆醇刺激18h可升高SIRT3表達水平2倍以上。我們利用血管緊張素2(Angll)刺激誘導心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞分化,發(fā)現(xiàn)肌成纖維細胞重要標志物α-SMA在Angll刺激后表達明顯升高。白藜蘆醇刺激可以明顯降低心肌成纖維細胞α-SMA表達,但當使用小干擾RNA降低SIRT3表達時,白藜蘆醇未能降低α-SMA表達。實時定量PCR檢測同樣發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可降低Angll升高的TGF-β及α-SMA基因表達水平,當給予小干擾RNA降低SIRT3表達時,白藜蘆醇未能降低TGF-β及α-SMA基因表達水平。7.白藜蘆醇激活SIRT3可抑制TGF-β通路及轉錄因子SMAD3活性我們在實驗中觀察到,TGF-β在體內和體外纖維化模型中表達均升高,為了探討SIRT3抗纖維化作用是否與TGF-β通路抑制有關,我們在實驗中觀察到白藜蘆醇干預可以降低TGF-β受體(TGF-β1, TGF-β2)、P-SMAD3及總SMAD3表達水平。且作為轉錄因子SMAD3的靶基因--纖溶酶原激活物抑制物1(PAl-1)其表達水平也被SIRT3下調。因此白藜蘆醇激活SIRT3可能通過抑制TGF-β通路起到改善心肌纖維化的作用。TGF-β通路發(fā)揮促纖維化作用依賴于磷酸化的SMAD3,因其磷酸化后通過核轉位作用進入胞核發(fā)揮轉錄活性。隨后,通過細胞免疫熒光方法及Western blot技術我們觀察到Angll刺激可以誘導心肌成纖維細胞中SMAD3的核轉位作用,白藜蘆醇干預抑制了SMAD3的核轉位作用,但當給予小干擾RNA時,白藜蘆醇這一抑制作用消失。上述結果提示白藜蘆醇激活SIRT3的抗纖維化作用部分依賴于抑制TGF-β/SMAD3通路。結論：1.SIRT3激活可抑制心肌纖維化及心臟功能減低2.白藜蘆醇可升高小鼠心肌內SIRT3表達水平。3.SIRT3的抗心肌纖維化作用依賴于對TGF-β/SMAD3通路的抑制作用。
【關鍵詞】：SIRT3 心肌肥厚 脂質累積 長鏈脂酰輔酶A脫氫酶 去乙�；鞍酌窼IRT3 心肌纖維化 轉化生長因子-β
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2
【目錄】：

• 論文一：SIRT3對小鼠心肌肥厚中線粒體脂質代謝障礙的影響及其機制研究8-66
• 中文摘要Ⅰ8-14
• 英文摘要Ⅰ14-22
• 符號說明Ⅰ22-24
• 前言24-27
• 材料與方法27-42
• 結果42-46
• 討論46-50
• 創(chuàng)新點50
• 局限性50
• 結論50-51
• 參考文獻51-55
• 附圖55-66
• 論文二：SIRT3激活對小鼠心肌肥厚中纖維化的影響及機制研究66-124
• 中文摘要Ⅱ66-73
• 英文摘要Ⅱ73-82
• 符號說明Ⅱ82-84
• 前言84-87
• 材料與方法87-101
• 結果101-105
• 討論105-108
• 創(chuàng)新點108
• 局限性108
• 結論108-109
• 參考文獻109-113
• 附圖113-124
• 致謝124-125
• 攻讀博士學位期間科研情況125-126
• 學位論文評閱及答辯情況表126-127
• 已發(fā)表英文論著Ⅰ127-156
• 已發(fā)表英文論著II156-183

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前10條

1 喻倫銀,劉漢橋;錳對培養(yǎng)的小鼠心肌超氧化物歧化酶活性的影響[J];基礎醫(yī)學與臨床;1991年04期

2 金玉蘭,岑浩望,陳鋼;衰竭性運動對小鼠心肌結構影響的初步觀察[J];中國運動醫(yī)學雜志;1992年01期

3 張為式;李亦秀;崔英梅;谷春山;孫尚奎;李文漢;;衛(wèi)矛對小鼠心肌攝取~(131)銫的影響[J];中國藥學雜志;1981年07期

4 白忠貞,韓惠芬,高秀峰;噪聲對小鼠心肌鈣、鎂代謝影響的實驗研究[J];職業(yè)醫(yī)學;1991年05期

5 王永梅,王雪峰;克隆測序技術在小鼠心肌炎實驗中的應用[J];遼寧中醫(yī)學院學報;2004年01期

6 沈筱云;羅健東;;音猬因子在正常小鼠和糖尿病小鼠心肌中的表達比較[J];廣州醫(yī)學院學報;2007年06期

7 黃偉民;閻徐鈞;;黃連素對小鼠心肌內總鈣濃度的影響[J];中國藥學雜志;1990年01期

8 潘毅生,張小娜,吳崇杰,刁勝林,呂興盛;心88對小鼠耐缺氧及其心肌攝取~(86)銣能力的影響[J];湛江醫(yī)學院學報;1991年01期

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中國重要會議論文全文數(shù)據庫 前10條

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5 張健發(fā);馬依彤;楊毅寧;劉芬;陳邦黨;李曉梅;向陽;;后適應缺血時間窗的選擇對小鼠心肌再灌注損傷的影響[A];中華醫(yī)學會心血管病學分會第十次全國心血管病學術會議匯編[C];2008年

6 孫香蘭;Laurie Goodyear;高聆;趙家軍;;SNARK調節(jié)小鼠心肌運動及缺血刺激的葡萄糖攝取[A];中華醫(yī)學會第十一次全國內分泌學學術會議論文匯編[C];2012年

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8 楊戈;歐陽五慶;劉玉梅;王俊;張黎;楊光敏;;EMP對果蠅抗衰老和小鼠心肌抗氧化作用的研究[A];全國動物生理生化第十次學術交流會論文摘要匯編[C];2008年

9 韓彩霞;張子群;路義鑫;李曉云;趙宇;宋銘忻;;瘦素與巨噬細胞轉移抑制因子對感染旋毛蟲小鼠心肌損傷致病機制的研究[A];第3屆全國人畜共患病學術研討會論文集[C];2011年

10 趙yN鐳;王晨;杜智敏;;膽堿通過調節(jié)miR-133a抗小鼠心肌肥厚作用及機制研究[A];2012年中國藥學大會暨第十二屆中國藥師周論文集[C];2012年

中國博士學位論文全文數(shù)據庫 前9條

1 陳桐帥;SIRT3對小鼠心肌肥厚中線粒體脂質代謝障礙及纖維化的影響及機制研究[D];山東大學;2015年

2 李傳保;乙醛脫氫酶2對代謝綜合征小鼠心肌的保護作用及機制研究[D];山東大學;2015年

3 邸若岷;雷帕霉素改善小鼠心肌梗死后心室重構的分子機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2010年

4 程姝娟;Toll樣受體4在內毒素誘導的小鼠心肌炎癥因子表達和左室功能不全中的作用[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2004年

5 王振華;新生小鼠心肌再生機制的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2013年

6 陳蓉;蛇床子素抑制異丙腎上腺素誘導小鼠心肌纖維化及其機制研究[D];蘇州大學;2012年

7 王永梅;黃芩甙抗CVB_（3m）和調控CVB_（3m）感染小鼠心肌免疫損傷及細胞凋亡的實驗研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2003年

8 周密;MiR-17-92簇在小鼠心肌缺血—再灌注中的作用[D];復旦大學;2011年

9 劉銳;心外膜在新生小鼠心肌再生過程中作用機制的實驗研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據庫 前10條

1 陳元元;胰島素樣生長因子Ⅱ受體在病毒性心肌炎小鼠心肌中的表達上調[D];安徽醫(yī)科大學;2015年

2 劉浩;不同負荷游泳運動對小鼠心肌血管內皮生長因子表達的影響[D];武漢體育學院;2007年

3 楊戈;玉米幼芽提取物對果蠅抗衰老和小鼠心肌抗氧化作用的研究[D];西北農林科技大學;2007年

4 關煜;LY-96在小鼠心肌肥厚及纖維化中的作用研究[D];華中科技大學;2013年

5 曹琳琳;烏蘇里藜蘆生物堿對小鼠心肌肥大保護作用的實驗研究[D];大連醫(yī)科大學;2008年

6 劉波;雷帕霉素干預炎癥因子對小鼠心肌梗死的保護作用[D];華中科技大學;2012年

7 趙宇;瘦素與巨噬細胞轉移抑制因子對感染旋毛蟲小鼠心肌損傷致病機制的研究[D];東北農業(yè)大學;2011年

8 陳琛;耐力、抗阻和混合訓練對TNF-α介導的C57BL/6小鼠心肌細胞凋亡的影響[D];華東師范大學;2010年

9 付珊珊;依那普利對新方法造小鼠心肌梗死模型外周血TNF-α、Th1/Th2、Treg/Th17的調節(jié)作用[D];南方醫(yī)科大學;2014年

10 王悅;A乳劑對阿霉素所致小鼠心肌損傷的保護作用及其機制[D];沈陽藥科大學;2009年

  本文關鍵詞：SIRT3對小鼠心肌肥厚中線粒體脂質代謝障礙及纖維化的影響及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：255085