【摘要】：目的:通過實驗研究確定朱砂安神丸(Zhusha-anshen-wan,ZS ASW)拮抗創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(Posttraumatic Stress Disorder,PTSD)及其所致睡眠障礙的作用及作用機制。方法:第一部分:朱砂安神丸對PTSD大鼠場景恐懼消退的影響一、朱砂安神丸對PTSD大鼠場景恐懼習(xí)得、消退和消退保持的影響(恐懼消退范式一)SD雄性大鼠50只,隨機將其分為假操作組、模型組、陽性藥(哌唑嗪)組、朱砂安神丸(ZS AS W)高、低劑量組,每組10只動物。單程長時應(yīng)激(Single prolonged stress,SPS)法復(fù)制PTSD模型。實驗第8日起開始藥物干預(yù),朱砂安神丸高、低劑量按1.08 g/kg和0.54g/kg,哌唑嗪劑量按O.5mg/kg每日一次灌胃給藥,共給藥6天,假操作組和模型組給予相應(yīng)體積蒸餾水。條件性恐懼實驗監(jiān)測系統(tǒng)記錄大鼠僵直時間,以此作為觀察指標研究朱砂安神丸對PTSD大鼠場景恐懼習(xí)得、消退和消退保持的影響。二、朱砂安神丸聯(lián)合多次消退訓(xùn)練對大鼠場景恐懼消退的影響(恐懼消退范式二)SD雄性大鼠50只,隨機將其分為假操作組、模型組、陽性藥(哌唑嗪)組、朱砂安神丸高、低劑量組,每組10只動物。SPS法復(fù)制PTSD模型。實驗第9日起開始消退訓(xùn)練,同時開始藥物干預(yù),朱砂安神丸高、低劑量按1.08 g/kg和0.54 g/kg,哌唑嗪劑量按0.5 mg/kg每日一次灌胃給藥,共給藥5天,假操作組和模型組給予相應(yīng)體積蒸餾水。條件性恐懼實驗監(jiān)測系統(tǒng)記錄大鼠5次消退訓(xùn)練的僵直時間,以此作為觀察指標研究朱砂安神丸對PTSD大鼠場景恐懼消退的影響。三、朱砂安神丸對PTSD大鼠自主活動的影響SD雄性大鼠60只,隨機將其分為空白對照組,朱砂安神丸高、低劑量組、SPS模型組,SPS+ZSASW高劑量組、SPS+ZSASW低劑量組,每組10只動物。實驗第8日起開始藥物干預(yù),朱砂安神丸高、低劑量按1.08 g/kg和0.54 g/kg,每日一次灌胃給藥,共給藥6天,空白對照組和SPS模型組給予相應(yīng)體積蒸餾水。以大鼠在開野實驗箱中的運動時間和運動距離為評價指標來研究朱砂安神丸處置和SPS應(yīng)激兩個因素間的交互作用和主效應(yīng)。第二部分:朱砂安神丸對PTSD大鼠睡眠的影響一、實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)睡眠探測分析模塊用于分析大鼠睡眠模式的方法評價SD雄性大鼠20只,隨機將其分為腦電圖(EEG)睡眠分析組和實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)(CLAMS)睡眠分析組,每組10只動物。分別用CLAMS動物監(jiān)測系統(tǒng)和皮層腦電圖對正常大鼠睡眠進行記錄和分析,以大鼠睡眠時間(Sleep time,ST)、覺醒次數(shù)(Awakening number,AN)和短時覺醒次數(shù)(Brief awakening number,bAN)為評價指標,比較兩種方法在分析睡眠相關(guān)指標上的差異。二、建立篩選共病睡眠障礙PTSD大鼠的方法SD雄性大鼠60只,隨機將其分為空白對照組和應(yīng)激暴露組,空白對照組20只大鼠,應(yīng)激暴露組40只大鼠。應(yīng)激暴露組大鼠接受SPS應(yīng)激,以大鼠在新異環(huán)境中的僵直時間作為評價指標將暴露組大鼠分為高反應(yīng)(High response,HR)和低反應(yīng)(Low response,LR)兩個亞組。利用CLAMS系統(tǒng)記錄大鼠睡眠,以大鼠睡眠時間、覺醒次數(shù)和短時覺醒次數(shù)為評價指標,研究HR和LR大鼠睡眠模式的差異性,并對大鼠僵直時間(在新異環(huán)境中的僵直時間)與睡眠指標的相關(guān)性進行分析。三、朱砂安神丸對PTSD大鼠睡眠的影響SPS法復(fù)制PTSD模型動物,以動物在新異環(huán)境中的僵直時間為依據(jù)篩選出高反應(yīng)(HR,Freezing60%)大鼠(雄性SD大鼠)40只,體重均衡下隨機分為四組,即模型組、陽性藥(哌唑嗪)組、朱砂安神丸高、低劑量組,每組10只動物,另設(shè)一組空白對照組(不接受SPS應(yīng)激)。實驗第8日起開始藥物干預(yù),朱砂安神丸高、低劑量按1.08 g/kg和0.54 g/kg,哌唑嗪劑量按0.5 mg/kg每日一次灌胃給藥,共給藥6天,空白對照組和模型組給予相應(yīng)體積蒸餾水。利用CLAMS系統(tǒng)記錄分析大鼠睡眠,以大鼠睡眠時間、覺醒次數(shù)和短時覺醒次數(shù)為評價指標,研究朱砂安神丸對PTSD大鼠活動相(暗相)及睡眠相(明相)睡眠模式的影響。第三部分:基于LC-NA神經(jīng)系統(tǒng)的朱砂安神丸改善PTSD大鼠恐懼消退障礙和睡眠障礙的神經(jīng)生物學(xué)機制研究一、基于LC-NA神經(jīng)系統(tǒng)的朱砂安神丸改善PTSD大鼠恐懼消退障礙的神經(jīng)生物學(xué)機制研究SD雄性大鼠65只,隨機將其分為假操作組、模型組、陽性藥(哌唑嗪)組、朱砂安神丸高、低劑量組,每組1 3只動物。SPS法復(fù)制PTSD模型。實驗第8日起開始藥物干預(yù),朱砂安神丸高、低劑量按1.08 g/kg和0.54 g/kg,哌唑嗪劑量按0.5 mg/kg每日一次灌胃給藥,共給藥6天,假操作組和模型組給予相應(yīng)體積蒸餾水。條件性恐懼實驗監(jiān)測系統(tǒng)記錄并分析大鼠僵直時間,以此作為觀察指標研究朱砂安神丸對PTSD大鼠場景恐懼習(xí)得、消退和消退保持的影響。利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)和熒光免疫組化技術(shù),以大鼠腦組織內(nèi)酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體1(Corticotropin releasing factor receptor-1,CRFR1)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin releasing factor,CRF)為指標,研究朱砂安神丸對以上指標的干預(yù)作用。二、基于LC-NA神經(jīng)系統(tǒng)的朱砂安神丸改善PTSD大鼠睡眠障礙的神經(jīng)生物學(xué)機制研究SPS法復(fù)制PTSD模型動物,以動物在新異環(huán)境中的僵直時間為依據(jù)篩選出高反應(yīng)(HR,Freezing60%)大鼠52只(SD雄性大鼠),HR大鼠隨機分為四組,即模型組、陽性藥(哌唑嗪)組、朱砂安神丸高、低劑量組,每組13只,另設(shè)一組空白對照組(不接受SPS應(yīng)激)。實驗第8日起開始藥物干預(yù),朱砂安神丸高、低劑量按1.08 g/kg和0.54 g/kg,哌唑嗪劑量按0.5 mg/kg每日一次灌胃給藥,共給藥6天,空白對照組和模型組給予相應(yīng)體積蒸餾水。利用CLAMS系統(tǒng)記錄大鼠睡眠,以大鼠睡眠時間、覺醒次數(shù)和短時覺醒次數(shù)為評價指標,研究朱砂安神丸對PTSD大鼠活動相(暗相)及睡眠相睡(明相)睡眠模式的影響。利用熒光定量PCR和熒光免疫組化技術(shù),以大鼠腦組織內(nèi)TH、CRFR1、CRF及尿液中皮質(zhì)酮(Corticosterone,CORT)為觀察指標,研究朱砂安神丸對以上指標的干預(yù)作用。結(jié)果:第一部分:朱砂安神丸對PTSD大鼠場景恐懼消退的影響一、朱砂安神丸對PTSD大鼠場景恐懼習(xí)得、消退和消退保持的影響(恐懼消退范式一)在場景恐懼習(xí)得和消退實驗中,各組大鼠的僵直時間均無顯著性變化。在消退保持測試中,在消退的第1 min內(nèi),與假操作組比,模型組動物僵直時間明顯高于假操作組(P0.01),兩者比較有顯著性差異。與模型組相比,陽性藥組和ZSASW高劑量組大鼠僵直時間明顯降低,與模型組比較有顯著性差異(P0.05和P0.01)。二、朱砂安神丸聯(lián)合多次消退訓(xùn)練對大鼠場景恐懼消退的影響(恐懼消退范式二)實驗結(jié)果表明:與假操作組相比,10～14日的消退訓(xùn)練中模型組動物僵直時間均明顯高于假操作組(P0.05或P0.01)。與模型組相比,陽性藥組僵直時間在第12、13和14日明顯減少(P0.05);ZSASW高劑量組大鼠在第13和第14日僵直時間明顯減少(P0.05和 P0.01)。三、朱砂安神丸對PTSD大鼠自主活動的影響開野實驗結(jié)果表明:對大鼠的活動距離的影響,SPS應(yīng)激和朱砂安神丸兩因素之間沒有交互作用(F(2,53)=1.244,P=0.2965)。SPS 應(yīng)激處理(F(1,53=0.001494,P=0.9693)和藥物處理(F(2,53)=0.5326,P=0.5902)的主效應(yīng)均無統(tǒng)計學(xué)意義。對于大鼠運動時間的影響,SPS應(yīng)激和朱砂安神丸處理兩因素之間沒有交互作用(F(2,53)=2.639,P=0.0808);SPS 應(yīng)激處理(F(1,53)=0.9319,P=0.3388)和藥物處理(F(2,53)=0.8356,P=0.4392)的主效應(yīng)均無統(tǒng)計學(xué)意義。第二部分:朱砂安神丸對PTSD大鼠睡眠的影響一、實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)睡眠探測分析模塊用于分析大鼠睡眠的方法評價EEG組動物與CLAMS組動物在睡眠時間和覺醒次數(shù)和短時覺醒次數(shù)上均沒有明顯的差異。二、建立篩選共病睡眠障礙PTSD大鼠的方法SPS應(yīng)激后第9日,與空白對照組比較,SPS暴露組大鼠睡眠時間沒有明顯變化,覺醒次數(shù)和短時覺醒次數(shù)明顯增多(P0.01和P0.05);高反應(yīng)組大鼠睡眠時間明顯減少(P0.05),覺醒次數(shù)和短時覺醒次數(shù)均明顯增多(P0.01)。SPS應(yīng)激后第14日,SPS暴露組大鼠僅短時覺醒次數(shù)增多(P0.05);高反應(yīng)組大鼠覺醒次數(shù)和短時覺醒次數(shù)明顯增多(P0.05和P0.01)。睡眠相關(guān)指標與新異環(huán)境中SPS大鼠僵直時間的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn),SPS暴露組大鼠和高反應(yīng)組大鼠睡眠時間、覺醒次數(shù)和短時覺醒次數(shù)均與大鼠在新異環(huán)境中僵直時間有相關(guān)性(P0.05或P0.01)。三、朱砂安神丸對PTSD大鼠睡眠的影響SPS應(yīng)激后第9日,在明相,與對照組大鼠相比較,模型組大鼠各項睡眠指標均有顯著性變化(P0.05或P0.01)。與模型組比較,陽性藥組和朱砂安神丸高、低劑量組大鼠睡眠各項指標均未有明顯影響。在暗相,與空白對照組大鼠相比較,模型組大鼠短時覺醒次數(shù)顯著升高(P0.05)。與模型組比較,陽性藥組和朱砂安神丸高、低劑量組大鼠短時覺醒次數(shù)均未有顯著性變化。SPS應(yīng)激后第14日,與對照組大鼠相比較,模型組大鼠覺醒次數(shù)和短時覺醒次數(shù)均有顯著性差異(P0.01)。與模型組比較,陽性藥組和高劑量朱砂安神丸組大鼠覺醒次數(shù)和短時覺醒次數(shù)均顯著降低(P0.05或P0.01);低劑量朱砂安神丸組大鼠短時覺醒次數(shù)顯著減少(P0.05)。在暗相,與對照組大鼠相比較,模型組大鼠短時覺醒次數(shù)顯著增加(P0.05)。與模型組比較,陽性藥組和高劑量朱砂安神丸組大鼠短時覺醒次數(shù)均顯著降低(P0.05)。第三部分:基于LC-NA神經(jīng)系統(tǒng)的朱砂安神丸改善PTSD大鼠恐懼消退障礙和睡眠障礙的神經(jīng)生物學(xué)機制研究一、基于LC-NA神經(jīng)系統(tǒng)的朱砂安神丸改善PTSD大鼠恐懼消退障礙的神經(jīng)生物學(xué)機制研究與假操作組相比,模型組大鼠LC內(nèi)TH和CRFR1二者的mRNA和蛋白表達明顯增強(P0.01和P0.05),CeA內(nèi)CRF mRNA和蛋白表達明顯增強(P0.01或P0.05),PVN中僅mRNA表達明顯增強(P0.05)。與模型組比較陽性藥哌唑嗪顯著降低了 TH mRNA和蛋白表達(P0.05 和 P0.01),以及 CeA 內(nèi) CRF mRNA 表達(P0.01);高劑量ZSASW明顯降低TH mRNA和蛋白表達(P0.01或P0.05),只降低 CRFR1蛋白(P0.05)和 CeA 內(nèi) CRF mRNA 表達(P0.01);低劑量ZSASW明顯降低CeA內(nèi)CRF mRNA(P0.01)表達。二、基于LC-NA神經(jīng)系統(tǒng)的朱砂安神丸改善PTSD大鼠睡眠障礙的神經(jīng)生物學(xué)機制研究對大鼠尿液中皮質(zhì)酮水平研究發(fā)現(xiàn)與假操作組相比,模型組大鼠暗相尿液中的CORT水平顯著升高(P0.05);明相CORT變化不明顯。與空白對照組相比,模型組大鼠LC內(nèi)的TH mRNA和蛋白表達均明顯增強(P0.01),PVN內(nèi)CRF mRNA和蛋白表達明顯增強(P0.05)。與模型組比較,陽性藥哌唑嗪使LC內(nèi)的TH mRNA和蛋白表達明顯下降(P0.05和P0.01),同時PVN內(nèi)CRF蛋白表達明顯下降(P0.05);高劑量ZSASW明顯降低TH mRNA和蛋白表達(P0.01),使PVN內(nèi)CRF蛋白表達明顯下降(P0.05)。結(jié)論:1、朱砂安神丸可以增強恐懼消退記憶的保持,提高恐懼消退的效率。2、朱砂安神丸有改善PTSD大鼠睡眠障礙的作用。3、朱砂安神丸改善PTSD大鼠恐懼消退障礙的作用一方面是由于藥物下調(diào)LC內(nèi)的CRFR1水平,同時又減弱了 CeA內(nèi)CRF mRNA表達,最終減弱了 CRF對LC的興奮作用,從而下調(diào)了 LC-NA的神經(jīng)功能,使恐懼表達(僵直)減少;另一方面,由于朱砂安神丸改善大鼠睡眠的作用,有利于消退記憶的鞏固,改善了 PTSD大鼠的場景恐懼消退障礙。4、朱砂安神丸改善PTSD大鼠睡眠障礙的作用與下調(diào)LC-NA神經(jīng)功能有關(guān),而LC-NA的上游調(diào)節(jié)機制可能與藥物降低了 PVN內(nèi)CRF表達有關(guān)。
【圖文】：

數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計分析。逡逑３．４實驗流程逡逑實驗流程如圖１所示，，實驗動物暴露于ＳＰＳ應(yīng)激當日（即模型逡逑復(fù)制當日）設(shè)為第０天，ＳＰＳ應(yīng)激步驟如３．４項下所示。假操作組逡逑動物除不暴露于ＳＰＳ應(yīng)激外，其它的操作均與余下四組相同（如離逡逑開通風(fēng)籠相同的時間，對動物進行捉拿和捏持等）。第８日起開始逡逑藥物干預(yù)，共給藥６次，每日一次灌胃給藥，給藥時間在１９：邋００－１９：逡逑４０之間。第１２日進行恐懼習(xí)得訓(xùn)練，各組大鼠均接受足底電刺激，逡逑電刺激參數(shù)和時間設(shè)置如３．６．１項中所示。第１３日各組大鼠進行消逡逑退訓(xùn)練，消退訓(xùn)練方法如３．６．２項中所示。第１４日所有實驗動物均逡逑４１逡逑

表１朱砂安神丸對大鼠場景恐懼習(xí)得的影響（３＾邋±邋Ｓ邋）逡逑Ｇｒｏｕｐ邐ＦＳ邐１邐ＦＳ邋２邐ＦＳ邋３邐ＦＳ邋４邐ＦＳ邋５逡逑Ｓｈａｍ邐１６．３６邋＋邋８．９９邐３５．８７邋＋邐７１．５邋１邋±邐７８．２３邋＋邋９．３邋１邐６４．３５邋＋逡逑１６．１１邐１８．３３邐１７．１５逡逑Ｍｏｄｅｌ邐２０．２０邋＋邐４３．５９邋＋邐７８．３２邋＋邐８１．７邋１邋＋邐７０．５９邋＋逡逑１２．６７邐１４．３３邐１５．４２邐１４．４７邐１９．３４逡逑Ｈｉｇｈ邐１７．７０邋＋邋８．６６邐４１，６５邋＋邐７５．５７邋＋邐８０．６５邋＋邐７２．９５邋＋逡逑１４．３５邐１２．０４邐１６．６２邐１０．５６逡逑Ｌｏｗ邐１９．６８邋＋邋９．４３邐４３．５２邋＋邐６８．９６邋＋邐８２．２７邋＋邐７４．９５邋＋逡逑１７．６３邐１１．５１邐１８．３９邐１７．５１逡逑ｐｒａｚｏｓｉｎ邐２１．１３邋＋邐４９．９４邋＋邐６１．４２邋＋邐６８．６４邋＋邐６１．３７邋＋逡逑邐１２．６９邐１６．３７邐１２．３９邐２０．１７邐２０．６５逡逑注：ＦＳｌ？ＦＳ５代表５個獨立的觀察單元。逡逑客＇逡逑？？．
【學(xué)位授予單位】：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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1 李海燕;;朱砂安神丸的方藥配伍分析與臨床應(yīng)用[J];中國醫(yī)藥指南;2009年18期

2 李天杰;朱砂安神丸臨床運用舉隅[J];四川中醫(yī);1986年09期

3 李鐘文,董桂蘭,蔣傳富,盛展能,熊少希;朱砂及朱砂安神丸鎮(zhèn)心安神功效的研究[J];中國中藥雜志;1993年07期

4 ;朱砂安神丸的藥理研究[J];江蘇中醫(yī);1995年12期

5 陳建明;錢e

本文編號：2545589