【摘要】：研究目的腦缺血再灌注損傷病理機(jī)制十分復(fù)雜,細(xì)胞凋亡是缺血性腦損傷重要原因之一。線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的三條主要途徑。近年來內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路在腦缺血再灌注損傷中的作用成為研究熱點(diǎn)。本研究采用線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血再灌注模型,探討電針百會(huì)、足三里穴對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用,并探討其作用機(jī)制是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān),為臨床治療腦血管病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法隨機(jī)數(shù)字表法將63只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和電針組,每組根據(jù)再灌注時(shí)間進(jìn)一步分為24h和72h亞組。利用線栓法建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注損傷模型,并分別在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)取材。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈,不插入線栓,模型組制作腦缺血再灌注模型,假手術(shù)組和模型組大鼠每日接受同電針組一樣的抓取束縛刺激。電針組造模成功后取百會(huì)、左足三里穴電針干預(yù)20min/日。在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)評估大鼠的神經(jīng)功能缺損程度;以TTC法評估大鼠腦梗死體積;Tunel法檢測腦組織細(xì)胞凋亡情況;免疫熒光染色觀察NeuN及GFAP表達(dá);免疫組織化學(xué)染色和免疫印跡法(Western blot)檢測腦缺血大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、磷酸化的真核細(xì)胞翻譯起始復(fù)合物2α(p-eIF2α)、Caspase12、Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá);采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測腦缺血大鼠 GRP78、CHOP、p-eIF2α、Caspase12、Bcl-2/Bax mRNA 的表達(dá)。研究結(jié)果1.神經(jīng)功能缺損情況:三組大鼠在造模前行為學(xué)表現(xiàn)一致,Longa評分為0分,且均能在10s之內(nèi)將前肢的粘附物移除。再灌注24h和72h,模型組、電針組大鼠Longa評分和粘附移除時(shí)間顯著高于假手術(shù)組(P0.05),造模后大鼠的感覺和運(yùn)動(dòng)均有下降;電針組大鼠在24h和72h的Longa評分均顯著低于模型組(P0.05);再灌注24h,電針組大鼠的粘附移除時(shí)間與模型組無明顯差異,再灌注72h,電針組大鼠粘附移除時(shí)間明顯較模型組縮短(P0.05)。2.腦梗死情況:再灌注72h,假手術(shù)組大鼠各個(gè)腦片均為紅色,未見腦梗死區(qū);模型組和電針組大鼠均存在不同程度白色梗死區(qū),主要分布于視交叉前后的大腦中動(dòng)脈供血區(qū),與動(dòng)脈栓塞的位置一致;電針組大鼠的腦梗死體積顯著低于模型組(P0.05)。3.TUNEL染色顯示:再灌注72h,模型組和電針組大鼠細(xì)胞凋亡顯著高于假手術(shù)組(P0.05);電針組細(xì)胞凋亡顯著低于模型組(P0.05)。4.免疫熒光染色顯示:再灌注72h,模型組和電針組大鼠的NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量顯著低于假手術(shù)組(P0.05);與模型組相比,電針組大鼠的NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P0.05);GFAP的結(jié)果與NeuN免疫熒光結(jié)果相反,再灌注72h,假手術(shù)組的GFAP陽性細(xì)胞體積小、突觸少,熒光強(qiáng)度較弱,提示星形膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài),模型組和電針組大鼠的GFAP陽性細(xì)胞體積大、突觸多,熒光強(qiáng)度強(qiáng),星形膠質(zhì)細(xì)胞處于活化狀態(tài);電針組大鼠的GFAP平均熒光強(qiáng)度顯著低于模型組(P0.05)。5.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo):(1)GRP78:①免疫組化:GRP78蛋白主要在胞漿表達(dá),假手術(shù)組GRP78蛋白呈低表達(dá),且顯著低于同一時(shí)間點(diǎn)的模型組和電針組(P0.05);電針組與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比,GRP78蛋白表達(dá)顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。②Western blot:模型組GRP78蛋白表達(dá)顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組(P0.05),電針組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)GRP78蛋白表達(dá)與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(P0.05)。③qPCR:模型組和電針組GRP78mRNA表達(dá)顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組;電針組GRP78mRNA表達(dá)均高于同一時(shí)間點(diǎn)的模型組(P0.05)。(2)CHOP:①免疫組化:CHOP蛋白在胞漿和胞核均有表達(dá),假手術(shù)組大鼠CHOP蛋白呈低表達(dá),再灌注24h,模型組CHOP蛋白表達(dá)與電針組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;再灌注72h,電針組CHOP蛋白顯著低于模型組(P0.05)。②Western blot:再灌注24h和72h,模型組和電針組CHOP蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P0.05);電針組與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比,CHOP蛋白顯著降低(P0.05)。③qPCR:同一時(shí)間點(diǎn)的模型組和電針組CHOPmRNA的表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P0.05);再灌注24h、72h,電針組CHOPmRNA的表達(dá)顯著低于模型組(P0.05)。(3)p-eIF2α:①免疫組化:假手術(shù)組p-eIF2α蛋白呈低表達(dá),再灌注24h及72h,模型組和電針組p-eIF2α蛋白表達(dá)顯著升高(P0.05);再灌注24h,模型組和電針組p-eIF2α蛋白表達(dá)無顯著性差異;再灌注72h,電針組p-eIF2α蛋白表達(dá)顯著低于模型組(P0.05)。②Western blot:模型組和電針組p-eIF2α蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組;電針組與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比,p-eIF2α蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。③qPCR:假手術(shù)組p-eIF2αmRNA呈低表達(dá),與假手術(shù)組相比,模型組和電針組p-eIF2αmRNA表達(dá)顯著升高(P0.05);電針組p-eIF2αmRNA表達(dá)顯著低于與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組(P0.05)。(4)Caspase 12:①免疫組化:Caspase 12胞漿胞核均有表達(dá),但以胞漿表達(dá)為主,與假手術(shù)組相比,模型組和電針組Caspase 12蛋白表達(dá)均顯著增高(P0.05);再灌注24h,電針組與模型組Caspase 12蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,再灌注72h,電針組Caspase 12蛋白表達(dá)顯著低于模型組(P0.5)。②Western blot:假手術(shù)組Caspase 12蛋白呈低表達(dá),模型組和電針組Caspase 12蛋白表達(dá)均顯著增高(P0.05);電針組與模型組相比,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Caspase 12蛋白表達(dá)均顯著降低(P0.05)。③qPCR:Caspase 12 mRNA表達(dá)與Western blotting法結(jié)果趨勢一致;電針組與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比,Caspase 12 mRNA表達(dá)顯著降低,差異具有顯著性(P0.05)。(5)Bcl-2/Bax:①免疫組化:模型組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于假手術(shù)組(P0.05),Bax蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P0.05);與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比,電針組Bcl-2蛋內(nèi)表達(dá)顯著升高;再灌注24h,模型組和電針組Bax蛋白表達(dá)無顯著性差異,再灌注72h,電針組Bax蛋白表達(dá)顯著低于模型組(P0.05)。②Western blot:模型組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于假手術(shù)組(P0.05),且在72h表達(dá)低于24h;模型組Bax蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P0.05),且在72h表達(dá)高于24h。電針組與模型組相比,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高,Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05)。③qPCR:Bcl-2及BaxmRNA表達(dá)趨勢同Westemblot;電針組與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比,Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著升高(P0.05),Bax mRNA表達(dá)顯著降低(P0.05)。結(jié)論1.電針百會(huì)、足三里穴能改善腦缺血再灌注72h大鼠的神經(jīng)功能缺損和腦梗死體積,并能降低細(xì)胞凋亡比例,對缺血腦組織具有一定的保護(hù)作用。2.電針百會(huì)、足三里穴可促進(jìn)腦缺血再灌注72h大鼠NeuN表達(dá)上調(diào),GFAP表達(dá)下調(diào),具有保護(hù)缺血半暗帶神經(jīng)元,減輕神經(jīng)元丟失,抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞增生活化的作用。3.大鼠腦缺血2h再灌注損傷24h及72h,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78、p-eIF2α、CHOP、Caspase 12的蛋白及mRNA表達(dá)增加,缺血再灌注損傷誘發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,電針百會(huì)、足三里穴可通過UPR促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù);上調(diào)腦缺血大鼠抑制凋亡基因Bcl-2表達(dá),下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中p-eIF2α、CHOP、Caspase 12蛋白及mRNA的表達(dá),減少凋亡基因Bax表達(dá),改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,減輕腦缺血再灌注損傷。4.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑在腦缺血再灌注損傷病理機(jī)制中有重要作用,本研究發(fā)現(xiàn)電針可能通過干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕腦缺血再灌注損傷。創(chuàng)新點(diǎn)以線栓法成功復(fù)制腦缺血再灌注損傷大鼠模型并采用電針百會(huì)、足三里穴干預(yù),通過檢測大鼠的神經(jīng)功能情況和腦梗死體積,直觀的驗(yàn)證了電針的有效性·,并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路作為切入點(diǎn),采用免疫組化、蛋白印跡、qPCR法分別從蛋白及基因水平檢測腦組織中GRP78、CHOP、p-eIF2α、Caspase 12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路上的重要指標(biāo)的表達(dá),探討電針百會(huì)、足三里穴對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的保護(hù)作用機(jī)制,為電針干預(yù)缺血性腦卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。經(jīng)國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索,尚未發(fā)現(xiàn)電針百會(huì)和足三里穴對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路分子GRP78、CHOP、p-eIF2α、Caspase 12的干預(yù)作用的研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R245.97

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本文編號(hào)：2435853