【摘要】：目的線粒體是阿霉素(Doxorubicin,DOX)心臟毒性作用的關鍵靶標,DOX誘導的心肌損傷的發(fā)生與發(fā)展與線粒體功能障礙密切相關。氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子1α(PGC-1α)是維持線粒體功能的重要分子,其介導的線粒體新生是維持線粒體數(shù)量平衡、保證線粒體正常功能的重要活動。DOX引發(fā)心臟毒性時會出現(xiàn)PGC-1α下調(diào)、線粒體新生障礙和線粒體功能紊亂,提示PGC-1α及其介導的線粒體新生障礙和線功能紊亂與DOX心肌毒性密切相關,但其具體調(diào)控方式和作用機制均不清楚。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關酶1(silent information regulation 2 homolog 1,SIRT1)是一種組蛋白去乙�；�,是PGC-1α去乙酰化激活酶。有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1缺失會導致PGC-1α乙酰化水平升高和活性降低,加劇心肌線粒體損傷,提示SIRT1去乙�；揎検荘GC-1α及與其相關的線粒體功能的重要調(diào)控機制。本研究假設SIRT1通過PGC-1α去乙酰化修飾和線粒體功能調(diào)節(jié)發(fā)揮其抗DOX心肌毒性作用。希望闡明DOX心臟毒性中SIRT1/PGC-1α在線粒體功能調(diào)節(jié)中的相互關系和作用特點,為深入探索DOX心臟毒性新機制、臨床毒副作用防治提供新思路。方法1.本研究首先對考察了SIRT1激活(激活劑RSV)或抑制(siRNA基因敲降)條件下,DOX所致細胞毒性、線粒體新生障礙和線粒體功能的變化,論證SIRT1在DOX所致心肌線粒體毒性作用機制中的重要靶標作用。SIRT1激活研究選擇了表征線粒體功能的指標,如采用流式細胞檢測法檢查細胞ROS和超氧化物含量、熒光顯微成像技術檢查線粒膜電位、試劑盒檢查ATP含量、CS活性等指標。同時還考察了反映線粒體新生的一系列指標,如Real-Time PCR檢查mtDNA拷貝數(shù)變化、熒光顯微成像技術檢查線粒含量、Western blot檢查PGC-1α介導的新生通路蛋白表達;并利用試劑盒檢測了SIRT1酶活性、IP和Western Blot方法檢查了SIRT1蛋白表達及PGC-1α的乙�；阶兓�,以考察SIRT激活對整個細胞和線粒體新生和功能的有益作用。隨后利用siRNA瞬時轉(zhuǎn)染構建SIRT1敲降細胞模型。利用該SIRT1敲降細胞考察DOX對細胞毒性、線粒體功能和新生的影響,分別考察了線粒體功能指標如細胞ROS、MMP、ATP含量,線粒體新生指標如mtDNA拷貝數(shù)、線粒體含量等,以論證SIRT1在維持正常細胞和線粒體功能、線粒體新生中的關鍵作用。2.本研究隨后考察了SIRT1在EPO發(fā)揮心臟保護中的關鍵作用。通過Western blot初步確定EPO對SIRT1有激活作用后,對EPO的保護效果與SIRT1是否有關進行考察。通過流式細胞術檢測線粒體內(nèi)超氧化物含量、JC-1染色熒光酶標法測定MMP以觀察EPO抗DOX線粒體功能損傷作用;通過Western blot考察線粒體新生通路PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白表達、線粒體內(nèi)參蛋白VDAC、COXIV蛋白表達、PCR檢測mt DNA拷貝數(shù)變化以觀察EPO抗DOX線粒體新生障礙的作用。還著重檢測了EPO抗DOX引起的SIRT1酶活性和蛋白表達降低以及PGC-1α乙�；缴摺檫M一步確定EPO的抗DOX毒性作用依賴于SIRT1存在,再次利用SIRT1敲降細胞進行實驗,選擇線粒體功能指標如線粒體超氧化物含量、ATP含量和MMP;線粒體新生指標如新生通路相關蛋白表達進行考察。3.最后本研究比較了單次給藥和重復給藥對細胞存活率和SIRT1/PGC-1α通路的影響。首先根據(jù)BMD(基準劑量法)利用BMDS2.5.0軟件擬合細胞生存率曲線,比較低劑量重復給藥后的細胞與單次給藥細胞的IC50和存活率BMDL值的變化;接著用Western blot檢測相同累積劑量不同給藥頻率單次給藥和重復給藥細胞SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達的不同。結(jié)果1.SIRT1在RSV抗DOX毒性中的關鍵作用。實驗結(jié)果顯示,DOX對AC16細胞生存率、線粒體新生和功能、SIRT1去乙�；富钚远加忻黠@抑制作用。而RSV能夠顯著提高同等DOX劑量下心肌細胞的存活率,改善線粒體功能,如降低ROS生成、改善MMP降低、CS活性抑制。RSV還能改善DOX對線粒體新生通路的抑制,逆轉(zhuǎn)阿霉素引起的線粒體DNA拷貝數(shù)降低,增強線粒體新生,增加線粒體數(shù)量。同時Western Blothe和IP結(jié)果也顯示,DOX引起的SIRT1活性降低和PGC-1α乙�；降纳呔躌SV的保護而發(fā)生明顯改善。同時,SIRT1敲降則加劇DOX對線粒體新生、線粒體結(jié)構和功能的影響。SIRT1敲降細胞在相同DOX給藥下存活率更低、線粒體DNA拷貝數(shù)和線粒體含量也降低更多,提示SIRT1表達降低會引起線粒體新生障礙。熒光顯微成像結(jié)果也顯示SIRT1敲降加劇了DOX導致的線粒體MMP的降低、ATP合成降低和ROS堆積,線粒體功能受到更加嚴重的破壞。RSV的保護作用也因為SIRT1敲降而顯著削弱。2.EPO抗DOX心臟毒性新機制與SIRT1的關系。實驗首先確認AC16細胞中EPOR的存在及EPO對SIRT1的確具有激活作用。接著實驗考察了給藥24 h的DOX引起AC16細胞毒性和線粒體功能障礙,以及EPO的保護作用。EPO能夠顯著改善DOX引起的AC16細胞生存率降低、線粒體功能障礙和線粒體新生障礙,如緩解DOX線粒體內(nèi)超氧化物堆積、SOD和CS表達降低以及MMP降低。同時,Western Blot和Real-time PCR結(jié)果顯示EPO還能夠顯著改善DOX引起的線粒體新生抑制,表現(xiàn)為緩解DOX造成的PGC-1α通路相關蛋白表達下降、mtDNA拷貝數(shù)降低、SIRT1和PGC-1α的mRNA表達降低。DOX造成的SIRT1蛋白表達和活性抑制、PGC-1α乙�；降纳�,均由于EPO的保護作用發(fā)生顯著改善。同時,SIRT1敲降細胞在相同DOX給藥劑量下也表現(xiàn)出更大的細胞毒性、更嚴重的線粒體新生和功能障礙,具體表現(xiàn)為mtDNA拷貝數(shù)降低更多,超氧化物生成量增加、ATP含量、MMP等指標均較未敲降細胞降低更多,且EPO的保護作用也因為SIRT1的敲降而遭到明顯削弱。提示EPO的保護作用依賴SIRT1存在。3.單次給藥與重復給藥對細胞重要指標的影響。方案A低劑量重復給藥后的細胞與單次給藥細胞的IC50和存活率BMDL值進行比較,發(fā)現(xiàn)低劑量重復給藥3天的細胞較單次給藥細胞對DOX毒性的耐受力顯著提高,表現(xiàn)為IC50值和BMDL增大;而相同低劑量重復給藥6天的細胞則較單次給藥細胞對DOX毒性作用的耐受力顯著降低,表現(xiàn)為IC50和BMDL降低。方案B相同累積劑量不同給藥頻率單次給藥和重復給藥細胞SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達結(jié)果進行比較,發(fā)現(xiàn)相同累積給藥劑量下,重復給藥導致SIRT1、PGC-1α及線粒體新生通路蛋白表達與單次給藥相比呈現(xiàn)顯著差異,重復給藥較單次給藥所造成的蛋白表達抑制更加嚴重。結(jié)論1.SIRT1是DOX毒性作用關鍵靶標,也是保護藥物抗DOX毒性作用的潛在活性靶點。本研究展示了已知的SIRT1激動劑RSV和保護機制未知的EPO在抗DOX心肌毒性中所表現(xiàn)出相似的對SIRT1激活、對線粒體功能和線粒體新生的促進作用,發(fā)現(xiàn)該保護作用均表現(xiàn)為對SIRT1的依賴性。在DOX引起的心肌毒性中,SIRT1由于其脫乙酰酶活性受到抑制而對線粒體新生通路產(chǎn)生擾動,造成線粒體新生及線粒體結(jié)構、功能障礙;而SIRT1激活劑則能夠明顯對抗DOX引起的線粒體毒性,維持心肌細胞結(jié)構和功能的相對穩(wěn)定。因此SIRT1有可能成為防治DOX心肌毒性的重要靶點,具有SIRT1激活作用的藥物有希望作為DOX聯(lián)合用藥的保護藥,減輕DOX臨床毒副作用,具有臨床現(xiàn)實意義。此外,SIRT1作為一種線粒體毒性通路關鍵分子,通過其自身活性變化和對目標分子的翻譯后修飾調(diào)節(jié),在維持心肌細胞正常生理功能中發(fā)揮重要作用;以此引申到其他翻譯后修飾作用,也具有成為新的毒性作用靶標和治療靶標的潛力和前景,這對于探索藥物毒性作用新機制、尋找有效保護藥物具有重要的現(xiàn)實意義。2.體外實驗DOX單次給藥和重復給藥對生存率和蛋白表達產(chǎn)生不同影響。重復給藥較單次給藥引起細胞對DOX的IC50、生存率BMDL發(fā)生顯著偏移;SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達發(fā)生顯著差異。提示單次給藥和重復給藥有可能涉及不同分子機制,需要進一步的詳細全面的論證和更為深入的研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R965

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本文編號：2411430