【摘要】：骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP)是一種骨骼強(qiáng)度減弱,易于骨折的疾病,影響全世界數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的人。骨質(zhì)疏松癥的治療方法通常包括藥物治療和干預(yù)措施,比如礦物質(zhì)的補(bǔ)充,改變生活方式和加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)鍛煉等。鑒于中藥副作用小,治療成本較低的優(yōu)點(diǎn),使得其被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐,已有2000多年歷史。骨碎補(bǔ)具備補(bǔ)腎強(qiáng)骨之功效,能促成骨質(zhì)愈合,治療骨質(zhì)疏松。柚皮苷是骨碎補(bǔ)的主要活性物質(zhì),為單一的化學(xué)成分。有研究表明,柚皮苷具備促成成骨細(xì)胞增殖和分化以及減少破骨細(xì)胞形成的雙重作用,并且還能抑制藥物誘導(dǎo)的OP。因而我們推測(cè)具有雙重作用的柚皮苷可在減少破骨量的同時(shí)增加成骨量,從而能糾正OP狀態(tài)下成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的失衡,起到抗OP的效果。在本次實(shí)驗(yàn)中,我們將圍繞上述展開研究,主要部分分述如下:1柚皮苷作用后,成骨細(xì)胞增殖,分化的改變(1)目的研究柚皮苷作用下,乳鼠原代培養(yǎng)的顱頂骨成骨細(xì)胞(rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖,分化,成熟的改變。(2)方法實(shí)驗(yàn)對(duì)象為出生4天的乳鼠顱頂骨,二次酶消化法獲取原代成骨細(xì)胞,3 d換液1次,待細(xì)胞融合80%后傳代。采用不同濃度的柚皮苷進(jìn)行藥物干預(yù),CCK-8法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖率,同時(shí)檢測(cè)不同濃度柚皮苷作用不同時(shí)間點(diǎn)的堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,alp)活性,茜素紅染色顯示鈣化結(jié)節(jié)。elisa法檢測(cè)柚皮苷組,對(duì)照組之間的骨鈣素(osteocalcin,ocn)、骨橋蛋白(oesteopontin,opn)的蛋白水平是否有所不同;realtimert-pcr檢測(cè)成骨細(xì)胞相關(guān)因子alp,ocn,opn的mrna水平。(3)結(jié)果:柚皮苷作用后,cck-8檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞的增殖具有明顯增加。當(dāng)1mg/l濃度組培養(yǎng)至第3d時(shí),細(xì)胞增殖開始出現(xiàn)差別(p0.05),培養(yǎng)至9d時(shí),增殖最為明顯(p0.01)。10mg/l濃度組在培養(yǎng)至9d時(shí),也表現(xiàn)出了促增殖的效果(p0.05)。alp染色后,柚皮苷處理組呈現(xiàn)出更高的alp活性。藥物濃度為1mg/l時(shí),柚皮苷明顯提高ocn,opn的分泌量。pcr結(jié)果也顯示,柚皮苷作用后,成骨相關(guān)的因子alp,ocn,opnmrna的表達(dá)得到了促進(jìn)。(4)結(jié)論柚皮苷有助于促進(jìn)rob的增殖與分化成熟,藥物濃度為1mg/l時(shí)作用更為明顯,并且存在時(shí)間相關(guān)性,對(duì)于骨質(zhì)疏松癥的防治有一定的作用。2鼠顱頂骨器官培養(yǎng)中,柚皮苷對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的影響(1)目的建立骨器官培養(yǎng)模型初步研究柚皮苷調(diào)解共存的骨細(xì)胞之間平衡狀態(tài)的作用機(jī)制(2)方法取出生4天鼠顱頂骨,分離出顱頂骨,于α-mem培養(yǎng)。采不同濃度柚皮苷作用后,he染色,trap染色,鈣離子濃度檢測(cè),pcr檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)因子opg,rankl的mrna水平。(3)結(jié)果柚皮苷作用下,he染色后新骨生成有明顯的增加,切片骨厚度可見明顯增加,成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果提示以1mg/l增加最為顯著(p0.05),其次為10mg/l濃度組。柚皮苷處理后,隨著時(shí)間的推移,骨器官的trap染色越來(lái)越淺,表明破骨細(xì)胞著色數(shù)量有減少的趨勢(shì),破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果提示以1mg/l減少最為顯著(p0.05)。rt-pcr結(jié)果顯示,柚皮苷作用組,成骨分化基因opg的表達(dá)增加(p0.05),破骨分化基因rankl的表達(dá)有所減少(p0.05)。(4)結(jié)論采用骨器官培養(yǎng)模型研究發(fā)現(xiàn),在共培養(yǎng)時(shí),柚皮苷具有促進(jìn)成骨的作用,同時(shí)也具有抑制破骨的效應(yīng),其機(jī)制與rankl/opg/rank有一定關(guān)系。3將顯微ct和骨器官培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合起來(lái)用于中藥的研究(1)目的采用顯微ct掃描技術(shù),對(duì)柚皮苷對(duì)共存的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的影響進(jìn)行縱向研究和分析(2)方法體外建立骨器官模型,分為三組,不同濃度柚皮苷作用后,于不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行體外micro-ct的掃描,三維重建后,相關(guān)參數(shù)分析。(3)結(jié)果不同時(shí)間點(diǎn)定量測(cè)量的不同濃度柚皮苷作用下的顱骨bs值與對(duì)照組比較,幾乎無(wú)明顯變化,只有在第16天,23天的時(shí)候,1mg/l濃度組與對(duì)照組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。于不同時(shí)間點(diǎn)定量測(cè)量的不同濃度柚皮苷作用下的顱骨bv值,bs/bv與對(duì)照組比較,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有明顯變化,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),在第16天,23天的時(shí)候,所有組均呈現(xiàn)時(shí)間效應(yīng),出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即骨體積都增長(zhǎng)明顯。1mg/l濃度組與對(duì)照組之間差別明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。10mg/L濃度組與對(duì)照組之間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)結(jié)論經(jīng)過(guò)參數(shù)分析后,我們能夠發(fā)現(xiàn)柚皮苷作用下,顱頂骨厚度有所增加,在共培養(yǎng)時(shí),柚皮苷具有促進(jìn)成骨的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R580

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本文編號(hào)：2401435