【摘要】：PRDM14 是 PRDM(PRDI-BF1 and RIZ homologous domain-containing proteins)家族中的一員,是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子。其所具有的PR(PRDI-BF1 and RIZ homologous)結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)以及SET(Su(var)3-9 enhancer-of-zeste and trithorax)結(jié)構(gòu)域蛋白含有的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性使得PRDM14可以直接參與蛋白質(zhì)間的互作或?qū)崿F(xiàn)下游基因的表達(dá)調(diào)控。大量研究表明,PRDM14除了在哺乳動物原始生殖細(xì)胞特化、干細(xì)胞多能性維持和染色體表觀重編程等過程中發(fā)揮著重要的作用以外,還參與調(diào)控細(xì)胞分化、生長與凋亡,并且是多種癌癥的易感基因位點(diǎn)。但是現(xiàn)有研究對PRDM14參與癌癥發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制和影響腫瘤細(xì)胞耐藥性方面的討論較少。有研究表明,非小細(xì)胞肺癌患者中PRDM14所在染色體上的區(qū)段有高頻的基因拷貝數(shù)改變現(xiàn)象,且PRDM14在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁正常組織,這些提示我們該蛋白參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程。本研究利用慢病毒載體系統(tǒng)和CRISPR-Cas9系統(tǒng)分別構(gòu)建了過表達(dá)PRDM14和敲低PRDM14的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系,通過cell counting kit(CCK8)檢測細(xì)胞活力,細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況,發(fā)現(xiàn)在體外細(xì)胞水平,PRDM14可以促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖。利用BALB/c Nude免疫缺陷型裸鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明,PRDM14在體內(nèi)對A549細(xì)胞增殖同樣具有促進(jìn)效應(yīng)。為了進(jìn)一步了解PRDM14促進(jìn)A549細(xì)胞增殖的作用機(jī)制,本研究首先通過流式細(xì)胞術(shù)分析了 PRDM14異常表達(dá)對細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明過表達(dá)PRDM14可以加快A549細(xì)胞周期進(jìn)程;而干擾PRDM14的表達(dá),將使A549細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)換受到阻滯,阻礙了細(xì)胞周期。隨后實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果表明,PRDM14可以通過影響細(xì)胞周期蛋白cyclin B1、cyclinD1、cyclin E1,細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4、CDK6和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制子p21 mRNA水平的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控A549細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。為探究PRDM14是否對腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤等生物學(xué)特點(diǎn)有影響,本研究通過傷口愈合實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PRDM14可以顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明,PRDM14依賴于增加MMP/TIMP(細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶/細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物)的表達(dá)比例,特別是MMP2/TIMP2比例,來提高A549細(xì)胞的遷移能力。為了了解PRDM14在細(xì)胞耐藥過程中的作用,本研究將紫杉醇(Taxol)、長春地辛(VDS)、長春新堿(VCR)和順鉑類藥物(DDP)四種藥物分別濃度梯度處理PRDM14表達(dá)水平不同的各組細(xì)胞,利用CCK8和流式細(xì)胞術(shù)方法分析細(xì)胞活力和凋亡細(xì)胞比例的變化。結(jié)果表明,PRDM14可以抑制藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并降低A549細(xì)胞對化療藥物的敏感性。為了進(jìn)一步探究PRDM14參與細(xì)胞增殖和凋亡的相關(guān)機(jī)制,本研究利用western blot方法檢測了大量肺癌相關(guān)通路上蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明,過表達(dá)PRDM14顯著促進(jìn)了 p38 MAP激酶的磷酸化,增強(qiáng)了 NF-κB的活化并下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制子p27的表達(dá)。有趣的是,過表達(dá)PRDM14也上調(diào)了腫瘤抑制蛋白p53的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PRDM14的高表達(dá)可以促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力,并通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)因子的表達(dá)影響細(xì)胞周期進(jìn)程。PRDM14可以通過調(diào)控p38 MAPK信號通路抑制藥物刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,從而減弱A549細(xì)胞對化療藥物的敏感性。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步了解PRDM14的生物學(xué)功能及其對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控機(jī)制的研究提供了理論依據(jù),為PRDM14可以作為肺癌治療的靶基因這一預(yù)測提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉冰冰;張四洋;惠林萍;邱雪杉;崔澤實(shí);;PRDM14在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系[J];中國肺癌雜志;2010年09期

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本文編號：2372031