【摘要】：背景:結(jié)直腸癌位列全球惡性腫瘤相關(guān)死亡率的第四位。診治技術(shù)和新藥研發(fā)的不斷進(jìn)步,將結(jié)直腸癌帶入精準(zhǔn)化、個(gè)體化靶向治療的時(shí)代。然而,近年來發(fā)現(xiàn),并不是所有的病人都能夠從目前已有的靶向藥物獲益,因此更多的分子靶點(diǎn)和標(biāo)志物有待發(fā)現(xiàn),更多的靶向新藥有待研發(fā),更加精準(zhǔn)化、個(gè)體化的治療手段有待探索。病人來源移植瘤(patient-derived xenograft,PDX)模型逐漸廣泛地被應(yīng)用于多種癌癥的轉(zhuǎn)化研究。PDX移植瘤模型通過將病人的腫瘤組織直接接種于免疫缺陷裸鼠而建成。已有大量的證據(jù)表明,PDX移植瘤模型保留了原腫瘤的組織病理學(xué)特征和生長方式特點(diǎn),有良好的"仿真度"和準(zhǔn)確的臨床療效預(yù)測能力,可以成為藥物敏感性預(yù)測、新藥臨床前試驗(yàn)、藥物耐藥機(jī)制研究以及驗(yàn)證科研假說等方面成為重要的研究平臺(tái)。高通量組學(xué)技術(shù)(Omics technology),以其高輸出量與高解析度的特性,可以成為探索抗腫瘤藥效反應(yīng)機(jī)制、篩選預(yù)測標(biāo)志物、尋找耐藥解決方案的重要工具。多維度組學(xué)技術(shù)的結(jié)合,可以更為全面、可靠地尋找與臨床表型相對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記。過去幾年的臨床試驗(yàn)表明血管靶向藥物抗腫瘤能帶來一定的臨床獲益。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)貫穿于惡性腫瘤整個(gè)生長周期,因此VEGF是研發(fā)抗腫瘤血管生成藥物的理想靶點(diǎn)。VEGF靶向藥物已經(jīng)被證實(shí)在多種腫瘤的治療中具有較好的抑制新生血管生成的作用,然而仍然面臨原發(fā)或繼發(fā)耐藥的問題。目前血管靶向藥物經(jīng)證實(shí)有效的藥效預(yù)測生物標(biāo)志物的缺乏成為精準(zhǔn)用藥的最大障礙和瓶頸,因此尋找血管靶向藥物的敏感性預(yù)測生物標(biāo)志物成為迫切的需要。另外,如何解決血管靶向藥物原發(fā)或繼發(fā)耐藥成為一個(gè)重大的挑戰(zhàn),對(duì)血管靶向藥物的耐藥機(jī)制的深入研究成為迫切需要。血管靶向藥物聯(lián)合化療藥的抗腫瘤協(xié)同作用的機(jī)制是血管靶向藥物具有使腫瘤血管正�；饔脧亩龠M(jìn)了化療藥物運(yùn)輸?shù)竭_(dá)腫瘤內(nèi)部組織,血管正�；接邉t協(xié)同作用愈強(qiáng),而血管正常化的時(shí)間窗是由血管靶向藥物的劑量和用藥時(shí)間決定的,因此血管正�；谋O(jiān)測分子標(biāo)志物可以有助于更加合理調(diào)整血管靶向藥物聯(lián)合化療藥物的劑量和用法。血管生成素1(Ang-1)以及與之天然對(duì)抗的血管生成素2(Ang-2)是血管成熟化、維持和重塑血管結(jié)構(gòu)的最重要的生長因子;Ang-1主要由外膜細(xì)胞(還有血管平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)分泌,Ang-2主要由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。腫瘤血管正�；茄苌纱龠M(jìn)和抑制之間的不平衡狀態(tài)得到糾正時(shí)出現(xiàn)的,而正�；苡奢^多外膜細(xì)胞覆蓋。因此,Ang-1/Ang-2比值可以在某種程度上反映這種動(dòng)態(tài)平衡以及血管外膜細(xì)胞的覆蓋程度,是具有潛力的血管正�；O(jiān)測標(biāo)志物,在血管靶向藥物聯(lián)合化療藥藥效中具有一定的預(yù)測價(jià)值。FP3(康弘藥業(yè)KH903)是我國自主研發(fā)的一種以VEGF為靶點(diǎn)的全人源化的可溶性受體蛋白,是將VEGFR1的第二個(gè)胞外區(qū)域以及VEGFR2的第三、四個(gè)胞外區(qū)域與人免疫球蛋白1(IgG1)Fc片段基因融合從而構(gòu)建的融合蛋白。近期FP3作為眼科藥物已在美國直接開展Ⅲ期臨床試驗(yàn),另外,研究亦發(fā)現(xiàn)FP3具有一定的抗腫瘤血管生成和抑制腫瘤增殖的作用。本論文目標(biāo)是基于腸癌PDX模型篩選和驗(yàn)證新型血管靶向藥物FP3抗腫瘤治療的藥效預(yù)測標(biāo)志物,為血管靶向藥物抗腫瘤個(gè)體化治療提供研究基礎(chǔ)。第一部分:目的:本部分研究的目的是建立結(jié)直腸癌患者新鮮腫瘤組織來源的裸鼠PDX移植瘤模型以作為藥效評(píng)估體系。方法:85例結(jié)直腸癌患者新鮮腫瘤組織接種于裸鼠皮下用于建立PDX移植瘤模型。HE染色、免疫組織化學(xué)染色、50腫瘤相關(guān)熱點(diǎn)突變基因二代測序panel以及NANO-LC/MS/MS蛋白質(zhì)液相二級(jí)質(zhì)譜檢測等方法用于初步鑒定PDX模型與臨床腫瘤組織遺傳分子特征的符合率以及在傳代過程中的生物學(xué)穩(wěn)定性。結(jié)果:成功建立了結(jié)直腸癌患者PDX移植瘤模型50例(成功率58.8%),通過HE染色,CEA、CK7、ki67、VEGF、FGFR2和VEGFR2的免疫組織化學(xué)染色對(duì)比,以及50腫瘤相關(guān)熱點(diǎn)突變基因二代測序pane1和NANO-LC/MS/MS蛋白質(zhì)液相二級(jí)質(zhì)譜檢測等都表明,結(jié)直腸癌PDX移植瘤組織與患者來源腫瘤組織在組織形態(tài)、基因突變狀態(tài)和蛋白表達(dá)等方面都顯示出與患者新鮮腫瘤組織高度的一致性。結(jié)論:本研究成功建立具有較高臨床仿真度的結(jié)直腸癌患者PDX模型,可以成為較好的抗腫瘤藥物評(píng)價(jià)體系。第二部分:目的:本部分研究基于結(jié)直腸癌PDX模型初步評(píng)估抗血管靶向新藥FP3單藥及與化療藥聯(lián)合藥效。方法:挑選1例第三代結(jié)直腸癌PDX模型,傳代后分為6組:(1)生理鹽水對(duì)照組;(2)FP3 組(20mg/kg iv qw);(3)貝伐單抗組(20mg/kg iv qw);(4)鹽酸伊利替康(CPT-11,5mg/kg ip qw)組;(5)FP3(20mg/kg iv qw)聯(lián)合鹽酸伊利替康(5mg/kg ip qw)組;(6)貝伐單抗(20mg/kg iv qw)聯(lián)合鹽酸伊利替康(5mg/kg ip qw)組。然后通過血管免疫熒光觀察CD31標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞受抑制情況,以及通過免疫組化觀察用藥后增殖相關(guān)抗原ki67的表達(dá)變化;另外通過CD31標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞、α-SMA標(biāo)記血管外膜細(xì)胞,分別觀察FP3單藥和聯(lián)合化療藥作用后腫瘤血管的正�；饔谩＝Y(jié)果:FP3組與貝伐單抗組有相近的RTI(相對(duì)腫瘤抑制率);FP3聯(lián)合CPT-11組與貝伐單抗聯(lián)合CPT-11組有相近的RTI。聯(lián)合用藥組RTI均高于單藥組。FP3用藥后CD31的免疫熒光表達(dá)下降,ki67組化表達(dá)下降。FP3聯(lián)合CPT-11下調(diào)ki67更明顯,而CD31下調(diào)程度與單藥作用相近。通過CD31、α-SMA標(biāo)記免疫熒光觀察,FP3單藥或聯(lián)合化療藥作用后,腫瘤血管均發(fā)現(xiàn)血管正�；饔谩＝Y(jié)論:FP3單藥可以有效抑制腸癌血管生長,從而抑制腫瘤生長;FP3聯(lián)合CPT-11抑制血管生長方面與單藥FP3相近,抑制腫瘤生長方面具有顯著的協(xié)同作用;FP3單藥和聯(lián)合化療藥療效與BEV相近;FP3作為單藥和聯(lián)合CPT-11用藥作用后都促進(jìn)腫瘤血管正�；�。第三部分:目的:本部分研究基于結(jié)直腸癌PDX模型和高通量組學(xué)技術(shù)篩選和驗(yàn)證FP3單藥藥效敏感性預(yù)測生物標(biāo)志物。方法:評(píng)估FP3單藥高濃度劑量(60mg/kg iv qw)對(duì)20例結(jié)直腸癌PDX模型的抗血管作用并將各用藥模型區(qū)分為FP3敏感組和不敏感組,進(jìn)而以多維度高通量組學(xué)技術(shù)對(duì)比檢測差異分子以篩選可能的FP3藥效預(yù)測生物標(biāo)志物并初步驗(yàn)證標(biāo)志物的有效性。結(jié)果:評(píng)估了 FP3對(duì)20例結(jié)直腸癌PDX模型的抗血管作用并將模型區(qū)分為FP3敏感組和不敏感組,進(jìn)而以50腫瘤相關(guān)熱點(diǎn)突變基因panel二代測序、轉(zhuǎn)錄組測序以及NANO-LC/MS/MS蛋白質(zhì)液相二級(jí)質(zhì)譜檢測等3個(gè)不同層面的高通量組學(xué)檢測以分別檢測FP3藥效敏感組和耐藥組之間差異DNA、RNA和蛋白質(zhì),通過生物信息學(xué)及文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)3個(gè)層面的高通量組學(xué)檢測結(jié)果在HIF-1α(缺氧誘導(dǎo)因子1α)蛋白表達(dá)調(diào)控通路上交疊。將此20例模型腫瘤組織檢測HIF-1α免疫組化蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)高表達(dá)組和低表達(dá)組有顯著的FP3藥效差異。FP3聯(lián)合HIF-1α抑制劑對(duì)單藥最不敏感的模型C70(KRAS突變型,HIF-1α高表達(dá))具有顯著的協(xié)同作用。血管免疫熒光發(fā)現(xiàn)FP3聯(lián)合HIF-1α抑制劑后可以顯著降低新生血管密度,另外免疫組化結(jié)果顯示HIF-1α抑制劑能顯著抑制HIF-1α的表達(dá),HIF-1α抑制劑聯(lián)合FP3能夠顯著下調(diào)ki-67的表達(dá)。進(jìn)一步,FP3組和HIF-1α抑制劑聯(lián)合FP3組進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn),Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)FP3單藥作用于C70第1天VEGF表達(dá)下調(diào)而第6天表達(dá)反跳,聯(lián)合HIF-1α抑制劑后VEGF可以被持續(xù)抑制。結(jié)論:研究結(jié)果初步確定HIF-1α及相關(guān)通路可能為FP3的藥效預(yù)測標(biāo)志物;HIF-1α的高表達(dá)促進(jìn)VEGF持續(xù)表達(dá)可能是FP3的耐藥的原因之一,FP3聯(lián)合HIF-1α抑制劑有潛力成為HIF-1α高表達(dá)導(dǎo)致FP3耐藥的逆轉(zhuǎn)治療,有待進(jìn)一步大樣本驗(yàn)證和機(jī)制研究。第四部分:目的:本部分研究為了初步探究Ang-1/Ang-2在FP3聯(lián)合化療藥藥效中的預(yù)測價(jià)值。方法:挑選FP3單藥評(píng)估耐藥的結(jié)直腸癌PDX移植瘤模型,評(píng)估FP3不同劑量濃度(7.5、15、30、60mg/kg iv qw)聯(lián)合相同劑量濃度(5mg/kg ip qw)化療藥鹽酸伊立替康(CPT-11)藥效,并分別取第0、7、14、21和28天的血清做ELISA檢測Ang-1/Ang-2比值,從Ang-1/Ang-2比值與不同劑量濃度藥效的對(duì)應(yīng)關(guān)系來驗(yàn)證Ang-1/Ang-2比值作為血管正�；奖O(jiān)測標(biāo)志物的可靠性。結(jié)果:FP3在15mg/kg劑量濃度時(shí)聯(lián)合CPT-11表現(xiàn)出最佳協(xié)同作用,通過血清ELISA檢測發(fā)現(xiàn):15和7.5mg/kg FP3聯(lián)合CPT-11治療后血清Ang-1/Ang-2比值都維持在緩慢的升高。15mg/kg FP3聯(lián)合CPT-11治療后血清Ang-1/Ang-2比值較7.5mg/kg高。30和60mg/kg FP3聯(lián)合CPT-11治療后血清Ang-1/Ang-2比值迅速升高。結(jié)論:Ang-1/Ang-2比值可以提示血管正�；�,對(duì)FP3聯(lián)合化療藥藥效具有一定的預(yù)測價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

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2 Verena Stiegelbauer;Samantha Perakis;Alexander Deutsch;Hui Ling;Armin Gerger;Martin Pichler;;MicroRNAs as novel predictive biomarkers and therapeutic targets in colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2014年33期

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本文編號(hào)：2355308