【摘要】：研究目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,典型的病理表現(xiàn)是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失,殘存的多巴胺能神經(jīng)元胞漿內(nèi)異常蛋白聚集體——路易小體(Lewy bodies,LBs),LBs由錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白組成。編碼α-突觸核蛋白的SNCA基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致帕金森病的遺傳因素。帕金森病是一個(gè)復(fù)雜基因疾病,普遍被認(rèn)為是由環(huán)境-遺傳因素交互作用所致。天然免疫受體調(diào)控改變腦老化的過程,尤其是在慢性炎癥的微環(huán)境長期作用之下,機(jī)體發(fā)生與衰老密切相關(guān)的神經(jīng)退化過程,這一系列發(fā)生發(fā)展機(jī)制可能受到遺傳易感性影響。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是最重要的免疫受體家族之一,參與人體多項(xiàng)免疫過程,TLRs在腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞表面高度表達(dá),激活免疫系統(tǒng),調(diào)節(jié)T細(xì)胞抗炎。隨著年紀(jì)增長,個(gè)體暴露在慢性炎癥環(huán)境中的危險(xiǎn)度也越高,TLR2作為TLRs家族中最重要的固有免疫受體,介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在老年退行性疾病中具有重要作用。環(huán)境-基因具有相互影響的作用,因此免疫相關(guān)基因位點(diǎn)的突變及遺傳多態(tài)性可能是個(gè)體易感的重要部分。TLR2通過多種不同的機(jī)制激活核因子k B(Nuclear factor k B,NF-k B)引發(fā)炎癥反應(yīng),包括TLR2介導(dǎo)的PI3K(Phosphatidylinositol-3-kinase)/AKT信號通路。研究證實(shí),TLR2活化P38及其下游受體的功能,能調(diào)節(jié)細(xì)胞中經(jīng)由PI3K-AKT依賴途徑的NF-KB的轉(zhuǎn)錄活性。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,在細(xì)胞內(nèi)信號通路中起重要作用,作為PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要中間分子,AKT1參與多種細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝,在多個(gè)細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)控中起重要作用,包括增殖、細(xì)胞周期、分化、存活和凋亡,對細(xì)胞存活至關(guān)重要。目前學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了超過26個(gè)基因位點(diǎn)和帕金森病有關(guān),約5-10%的帕金森病患者存在單基因突變,其中一些基因參與的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和降解,線粒體損傷和氧化應(yīng)激等一系列細(xì)胞機(jī)制。家族性帕金森病約占10%,但是帕金森病人中絕大多數(shù)為散發(fā)病例,現(xiàn)有的遺傳發(fā)現(xiàn)不能夠完全解釋散發(fā)性帕金森病的病因病理,散發(fā)帕金森病發(fā)病機(jī)制仍然需要進(jìn)一步闡明。隨著信號通路更多作用被發(fā)現(xiàn)和人們對基因多態(tài)性的深入理解,TLR2介導(dǎo)AKT1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與神經(jīng)炎癥的機(jī)制,在帕金森病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),尤其是散發(fā)性帕金森病中的角色和作用值得探討�；蚨鄳B(tài)性對帕金森病風(fēng)險(xiǎn)的影響取決于不同種族和人群。目前缺乏TLR2及AKT1基因多態(tài)性在漢族帕金森病人群中的研究。我們在這里探討免疫遺傳變異和散發(fā)性帕金森病患者之間的相互作用。我們假設(shè)TLR2和AKT1中的基因突變可能是帕金森病的風(fēng)險(xiǎn)因素,并且造成細(xì)胞先天免疫力的降低,從而影響種族人群中的帕金森病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。因此,我們設(shè)計(jì)一項(xiàng)病例對照研究,根據(jù)設(shè)計(jì)特點(diǎn),后期為了更好控制混雜因素,采用Logistic回歸分析,OR作為結(jié)局相對危險(xiǎn)度的近似估計(jì),反應(yīng)年齡、性別等暴露因素與帕金森病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。使用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-Restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法探討在漢族北方漢族人群中,TLR2基因和AKT1基因的單核苷酸多態(tài)性(Single-Nucleotide polymorphism,SNP):rs3804099,rs3804100(TLR2);和rs2498799,rs2494732、rs1130214(AKT1)的對散發(fā)性帕金森病的遺傳變異作用,并根據(jù)發(fā)病年齡和性別進(jìn)行分層分析,調(diào)查不同漢族人群中的帕金森病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)度。研究方法:采取病例-對照研究方法,病例組受試者主要來自山東、北京、天津、河北、山西、河南等省份地區(qū)的散發(fā)性帕金森病患者。納入病例均為漢族,根據(jù)英國帕金森病協(xié)會(huì)腦庫標(biāo)準(zhǔn),由2名運(yùn)動(dòng)障礙專家診斷散發(fā)性帕金森病。根據(jù)國際分類標(biāo)準(zhǔn),定義發(fā)病年齡50歲為早發(fā)型帕金森病,發(fā)病年齡≥50歲為晚發(fā)型帕金森病。對照組是與病例組年齡、性別匹配的正常健康人,均來自北方省份漢族人群。使用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對病例組和對照組進(jìn)行基因檢測。首先使用相關(guān)數(shù)據(jù)庫及軟件查詢SNP位點(diǎn)信息,選擇相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶,并根據(jù)不同位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物,并合成引物,其次提取納入受試者血液基因組DNA,進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng),通過紫外線透射儀成像,統(tǒng)計(jì)SNP位點(diǎn)基因型頻率。最后驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果,隨機(jī)選擇10%樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序,檢測基因型并與以上RFLP酶切結(jié)果進(jìn)行比對。所得基因型數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行相關(guān)處理和統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)、Logistic回歸檢驗(yàn)各個(gè)SNP位點(diǎn)基因型、等位基因頻率差異及對顯性遺傳模式、隱性遺傳模式進(jìn)行分析,并預(yù)測基因-疾病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)。結(jié)果:(1)TLR2基因的SNPrs3804099在散發(fā)性帕金森病患者中等位基因T頻率高于健康匹配對照,增加散發(fā)性帕金森病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.293,95%CI=1.044-1.601,P=0.019),顯性遺傳模型TT/TC+CC分布在病例組與夫?qū)φ战M之間有顯著差異,顯示與散發(fā)性帕金森病相關(guān),增加發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.376,95%CI=1.043-1.814,P=024)。進(jìn)一步進(jìn)行年齡/性別亞組分析,等位基因T在晚發(fā)型散發(fā)性帕金森病患者中分布(73.1%)高于對照健康人群(67.4%),與對照組相比具有顯著差異,增加散發(fā)性帕金森病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.319,95%CI=1.047-1.663,P=0.019)。此外,校正性別因素后,采用Logistic回歸分析,顯示晚發(fā)人群中rs3804099顯性遺傳模型(TT/TC+CC)在散發(fā)性帕金森病患者和健康對照之間的具有顯著差異(OR=1.417,95%CI=1.051-1.911,P=022)。(2)AKT1基因的SNPrs2498799位點(diǎn)等位基因G頻率在散發(fā)性帕金森病患者和對照組之間的有顯著差異,對發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有保護(hù)作用(OR=0.764,95%CI=0.587-0.995,P=0.045)。校正年齡因素后,采用Logistic回歸分析顯示GG/GA+AA在女性散發(fā)性帕金森病人群與對照組比較分布有顯著差異,對發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有保護(hù)作用(OR=0.538,95%CI=0.345-0.841,P=0.006),再進(jìn)一步將女性人群分為早發(fā)型和晚發(fā)型,發(fā)現(xiàn)在女性晚發(fā)散發(fā)帕金森病隊(duì)列中GG/GA+AA分布在病例-對照組間仍然存在顯著差異,并對發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有保護(hù)作用(OR=0.521,95%CI=0.309-0.877,P=0.012)。結(jié)論:TLR2基因SNPrs3804099多態(tài)性位點(diǎn)與漢族北部人群散發(fā)帕金森病相關(guān)聯(lián),通過進(jìn)一步性別/年齡亞組分析可以看出,晚發(fā)帕金森病人群中rs3804099顯性遺傳模型TT/TC+CC增加發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。一直以來,免疫功能障礙被認(rèn)為是老年帕金森病人的重要發(fā)病機(jī)制,因此免疫相關(guān)基因位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性可能是個(gè)體易感性的重要部分,同時(shí)長期慢性炎癥可能導(dǎo)致基因位點(diǎn)發(fā)生突變。根據(jù)這一系列的推論和結(jié)果綜合看來,我們考慮TLR2 rs3804099 T攜帶者可能更容易受炎癥介導(dǎo)的影響,特別是對于晚發(fā)性帕金森病人群來說,更具有免疫相關(guān)基因遺傳易感性,通過免疫介導(dǎo)途徑在TLR2基因rs3804099風(fēng)險(xiǎn)基因型攜帶者中發(fā)病。AKT1基因rs2498799位點(diǎn)在漢族北部女性人群中具有帕金森病保護(hù)作用。尤其是老年女性人群,等位基因G具有疾病保護(hù)作用。AKT1是參與不同信號傳導(dǎo)途徑的重要成員,相信隨著AKT1更多的作用被發(fā)現(xiàn)及其基因遺傳效應(yīng)的深入挖掘,我們在分子遺傳水平上能夠有更加透徹的認(rèn)識。TLR2和AKT1基因多態(tài)性均與中國北方漢族散發(fā)性帕金森病的人群具有風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)。我們可以假設(shè)TLR2和AKT1成為散發(fā)性帕金森病的候選基因之一。由此可以推測炎性因子TLR2介導(dǎo)的AKT1信號通路反應(yīng)可能參與到散發(fā)性帕金森病發(fā)生發(fā)展的分子生物機(jī)制之中,為進(jìn)一步的工作奠定了遺傳信息基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R742.5

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本文編號：2279556