【摘要】：目的瞬時(shí)感受器電位(transient receptor potential,TRP)超家族是一組非選擇性陽(yáng)離子通道,分為7個(gè)亞家族,TRPM亞家族包括8個(gè)不同的成員,TRPM1~8。TRPM2在可興奮細(xì)胞和非興奮細(xì)胞上廣泛表達(dá),其中胰島beta細(xì)胞上也發(fā)現(xiàn)了TRPM2的表達(dá),同時(shí)它可以形成Ca2+通透性陽(yáng)離子通道,在胰島beta細(xì)胞的胰島素分泌功能中發(fā)揮一定的作用。TRPM2通道可以被細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、H2O2、活性氧(ROS)、溫度以及Ca2+所激活。眾所周知,作為2型糖尿病的一個(gè)重要靶點(diǎn),胰高血糖素樣肽-1(glucagon-likepeptide1,GLP-1)具有保護(hù)胰島beta細(xì)胞,刺激其增值和分化,抑制其凋零,增加胰島beta細(xì)胞數(shù)量,減輕病人體重,抑制胃腸蠕動(dòng)和胃液分泌,抑制食欲,延緩胃排空促進(jìn)胰島素的合成和分泌等作用,然而在它眾多作用當(dāng)中我們對(duì)其可以增強(qiáng)葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)作用最感興趣并進(jìn)行了進(jìn)一步的深入研究。GLP-1的促胰島素分泌作用呈葡萄糖濃度依賴(lài)性,即只有在血糖水平升高的情況下,GLP-1才發(fā)揮降糖作用,而在血糖水平正常時(shí),則不會(huì)使其進(jìn)一步降低。GLP-1的這種葡萄糖濃度依賴(lài)性方式促進(jìn)胰島beta細(xì)胞分泌胰島素,同時(shí)減少胰島alpha細(xì)胞分泌胰高血糖素,從而降低血糖。細(xì)胞外葡萄糖濃度的變化將改變細(xì)胞內(nèi)ATP以及cAMP的水平,c AMP水平的變化將影響表達(dá)在胰島beta細(xì)胞上的TRPM2的狀態(tài),因此這些研究結(jié)果促使我們提出了以下設(shè)想:TRPM2有可能參與了GLP-1調(diào)節(jié)胰島素分泌的功能。本研究將結(jié)合GLP-1和TRPM2作為新視點(diǎn)探索并揭示胰島素分泌調(diào)節(jié)的發(fā)生機(jī)制,為預(yù)防治療糖尿病以及其并發(fā)癥開(kāi)辟了新的道路。方法選取健康Sprague-Dawley大鼠,分離并培養(yǎng)原代細(xì)胞。在室溫(22-25oC)下用膜片鉗放大器測(cè)量細(xì)胞膜電流。采用PCLAMP v.10.2軟件以及Digidata-1440A來(lái)發(fā)出指令點(diǎn)刺激并記錄數(shù)據(jù)。將細(xì)胞置于位于倒置顯微鏡載物臺(tái)上的bath(近似0.15 ml,被維持在37 oC)中,然后以HEPES緩沖的生理鹽水(含3.3mmol/L葡萄糖),高糖、高K+、TRPM2激動(dòng)劑、TRPM2抑制劑、PKA激動(dòng)劑和抑制劑、Epac激動(dòng)劑和抑制劑或10 nM的GLP-1等分子進(jìn)行孵育,流速為5 ml/min的進(jìn)行(原代細(xì)胞用電阻系數(shù)約為4.5 MΩ的玻璃電極),記錄離子通道電流以及通過(guò)記錄電容變化比較不同實(shí)驗(yàn)組中胰島素分泌的差異,并且通過(guò)連續(xù)的去極化刺激初步觀察上述刺激對(duì)兩相胰島素分泌的影響。經(jīng)過(guò)基因靜默和過(guò)表達(dá)處理的胰島beta細(xì)胞,也給予上述分子孵育,記錄離子通道電流、電容變化,并測(cè)量胰島素分泌水平。對(duì)基因靜默組及過(guò)表達(dá)組利用Western Blot,RT-PCR及電生理學(xué)測(cè)量來(lái)確定TRPM2的表達(dá)及活性水平。并對(duì)各組通過(guò)膜片鉗全細(xì)胞記錄法記錄離子通道的細(xì)胞膜電流強(qiáng)度情況來(lái)確定其活性程度,同時(shí)利用胰島素分泌實(shí)驗(yàn)加以佐證來(lái)確定TRPM2的活性或其表達(dá)水平是否與GLP-1的胰島素分泌調(diào)節(jié)作用相關(guān)。結(jié)果1.不同濃度葡萄糖刺激對(duì)TRPM2的影響:將原代細(xì)胞置于37攝氏度的高糖、正常糖溶液及低糖環(huán)境中15分鐘,對(duì)照組和低糖組之間TRPM2電流無(wú)明顯差異(P0.05),高糖組TRPM2電流強(qiáng)度峰值高于對(duì)照組(P0.05)。2.高鉀及GLP-1對(duì)TRPM2的影響:10 nM GLP-1刺激原代細(xì)胞后利用全細(xì)胞記錄法記錄TRPM2的峰值電流,與對(duì)照組相比GLP-1刺激可以顯著增強(qiáng)TRPM2電流強(qiáng)度(P0.05)。30 m M KCl刺激對(duì)TRPM2無(wú)影響(P0.05)。3.TRPM2基因靜默對(duì)胰島素分泌的影響:對(duì)對(duì)照組和siTRPM2組給予不同糖濃度刺激,分別測(cè)量0-10分鐘(一相分泌)以及10-60分鐘(二相分泌)的胰島素分泌水平。si TRPM2組與對(duì)照組相比,低糖和正常糖濃度水平下胰島素分泌情況無(wú)明顯差別(P0.05),但在高糖水平下胰島素一相分泌及二相分泌水平較對(duì)照組明顯下降(P0.05)。4.高鉀及GLP-1對(duì)胰島素分泌的影響:低糖水平下,si TRPM2組,GLP-1組,GLP-1+siTRPM2組胰島素分泌較對(duì)照組無(wú)明顯變化(P0.05)。KCl刺激以上各組后胰島素分泌水平較對(duì)照組均明顯增加(P0.05)。高糖水平下,GLP-1組胰島素分泌較對(duì)照組明顯增多(P0.05),GLP-1+si TRPM2胰島素分泌水平與對(duì)照組無(wú)差別(P0.05)。KCl處理各組后與各組此前的胰島素分泌水平相比無(wú)明顯變化(P0.05)。5.2-APB對(duì)GLP-1介導(dǎo)的GSIS影響:10μM 2-APB可顯著抑制過(guò)表達(dá)組及對(duì)照組TRPM2電流,GLP-1在高糖水平時(shí)可使胰島素分泌水平增加,而2-APB可以使GLP-1組的胰島素分泌水平降低至對(duì)照組水平,較之GLP-1組明顯下降(P0.05)。6.PKA、Epac的激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)GLP-1介導(dǎo)的GSIS的影響:PKA激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)TRPM2電流無(wú)顯著影響(P0.05)。與對(duì)照組相比,PKA激動(dòng)劑可以顯著增加GSIS。與GLP-1組相比,PKA抑制劑對(duì)GLP-1的促泌作用無(wú)明顯影響(P0.05)。Epac激動(dòng)劑可以顯著增強(qiáng)TRPM2電流,在Epac抑制劑的作用下GLP-1增強(qiáng)TRPM2電流的效果消失。同時(shí)Epac激動(dòng)劑可以顯著提升GSIS,在其作用下GLP-1的加入無(wú)法進(jìn)一步促進(jìn)胰島素分泌,而Epac抑制劑可抑制GLP-1的胰島素促泌作用(P0.05)。結(jié)論高濃度葡萄糖刺激可以增強(qiáng)TRPM2電流強(qiáng)度,低糖對(duì)TRPM2電流無(wú)影響。TRPM2參與了葡萄糖刺激的第一時(shí)項(xiàng)及第二時(shí)項(xiàng)的胰島素分泌。高鉀對(duì)TRPM2通道活性無(wú)影響,GLP-1可激活TRPM2,并通過(guò)此途徑調(diào)節(jié)胰島素分泌,KATP-Cav通路未參與GLP-1介導(dǎo)的GSIS。GLP-1通過(guò)Epac通路而非PKA通路調(diào)節(jié)GSIS,PKA通路通過(guò)其他作用機(jī)制調(diào)節(jié)GSIS,此調(diào)節(jié)作用與GLP-1的GSIS調(diào)節(jié)作用互補(bǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R587.1

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本文編號(hào)：2251642