【摘要】：能量代謝異常是腫瘤細胞的重大特征之一,主要表現(xiàn)為依賴有氧糖酵解進行能量代謝。有氧糖酵解代謝酶是調控有氧糖酵解代謝途徑的核心元件,其表達水平及活性異常與多種腫瘤的惡性化程度密切相關,是當前腫瘤代謝領域的研究重點。然而,目前對于代謝酶參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能認識仍非常有限,大多停留于傳統(tǒng)認識的腫瘤細胞惡性化增殖所必須的能量供給和生物合成兩大方面。事實上,新近有證據提示,代謝酶可能貢獻于腫瘤細胞惡性微環(huán)境的維持、表觀遺傳調控、侵襲遷移等諸多方面。全面認識代謝酶參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能,深入認識其分子機制,對于揭示腫瘤代謝在腫瘤惡性化進程中的作用具有重要意義,也將為靶向腫瘤代謝的抗腫瘤策略提供重要的理論依據。磷酸甘油酸變位酶PGAM1是有氧糖酵解途徑的重要代謝酶,通過催化3-磷酸甘油酸(3-PG)向2-磷酸甘油酸(2-PG)的轉變,參與有氧糖酵解途徑,在多種腫瘤中高表達或活性升高。新近研究報道了PGAM1通過其酶活功能同時調控磷酸戊糖和絲氨酸合成途徑,支持腫瘤細胞快速增殖的重要功能。PGAM1成為腫瘤代謝領域備受關注的分子。然而,關于PGAM1的認識仍非常有限,僅停留于能量供給和生物合成兩方面。本論文旨在全面認識PGAM1的生物學功能,深入探討其分子機制,旨在為全面認識PGAM1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供實驗依據,并為指導PGAM1抑制劑的使用及研發(fā)策略提供重要信息。首先,我們選用基于質譜的蛋白質組學技術,系統(tǒng)研究了干擾PGAM1功能可能影響的信號通路。結果發(fā)現(xiàn),除了預期的代謝和生物合成相關通路,PGAM1干擾細胞的DNA損傷應答相關通路顯著受到了影響。本文將著力對PGAM1在DNA損傷應答中可能扮演的角色進行探索。首先,為了確證PGAM1參與DNA損傷應答,我們以克隆形成等實驗為指標,檢測了干擾PGAM1對不同類型DNA損傷類藥物敏感性的影響。結果發(fā)現(xiàn)PGAM1能夠選擇性增強細胞對喜樹堿(CPT)和順鉑(CDDP)的敏感性,提示可能與CPT和CDDP造成的復制依賴的DNA雙鏈斷裂(DSBs)應答密切相關。通過研究藥物處理后DSBs特異性標志物γH2AX變化、dsDNA斷裂情況等多項生物學指標的動態(tài)變化情況,我們發(fā)現(xiàn)干擾PGAM1不影響初始DSBs損傷水平,但會導致細胞DNA修復缺陷。進一步采用DSBs兩條主要修復通路,即同源重組(HR)或非同源末端連接(NHEJ)的報告基因系統(tǒng),我們揭示PGAM1特異調控HR修復,而非NHEJ連接。為了研究PGAM1代謝酶活性是否貢獻于HR修復,我們構建了PGAM1酶活突變體。通過對比回轉野生型或酶活突變型PGAM1,我們發(fā)現(xiàn)PGAM1的DNA損傷修復功能是酶活依賴的。同時,使用PGAM1酶活抑制劑PGMI-004A或回補代謝產物methyl-2-PG均確認了上述結果�；赑GAM1同時參與糖酵解、磷酸戊糖和絲氨酸合成途徑的已有認識,我們系統(tǒng)比較了上述三條通路對于HR修復功能的貢獻。結果發(fā)現(xiàn),PGAM1主要通過影響磷酸戊糖旁路,參與HR修復�；匮a磷酸戊糖途徑終產物dNTP能夠逆轉PGAM1干擾引起的HR修復缺陷。為了進一步回答PGAM1如何影響磷酸戊糖途徑參與HR修復,本研究聚焦了HR修復的多個關鍵步驟。結合使用免疫熒光檢測修復蛋白foci形成等多項研究手段,發(fā)現(xiàn)干擾PGAM1影響CPT誘導的DSBs末端的單鏈DNA(ssDNA)暴露、阻礙RPA復合物的招募。而這一效應主要通過影響DSBs末端處理蛋白CtIP的功能實現(xiàn)。深入研究發(fā)現(xiàn),PGAM1通過調控細胞內dNTP的水平,導致p53/p73依賴的p21轉錄激活,后者通過上調E3泛素連接酶APC/Cdh1活性,導致CtIP蛋白穩(wěn)定性下降,蛋白水平下調。至此,本研究對PGAM1如何影響HR修復的分子機制進行了詳盡的闡述。依據上述機制發(fā)現(xiàn),我們對PGAM1抑制劑的臨床用藥策略進行探索。使用在裸小鼠皮下移植瘤模型,我們發(fā)現(xiàn)干擾PGAM1或聯(lián)用PGAM1抑制劑能夠增強Olaparib對BRCA野生型移植瘤的抑制作用,干擾PGAM1或聯(lián)用PGMI-004A能顯著下調腫瘤組織內CtIP蛋白水平,導致DNA損傷積累,進而誘導細胞凋亡。綜上,本論文發(fā)現(xiàn)了PGAM1調控HR修復的新功能,并揭示了PGAM1能夠通過調節(jié)胞內dNTP平衡、影響CtIP蛋白穩(wěn)定性,調控HR修復通路的分子機制,為認識PGAM1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的功能提供了新的證據。在此基礎上,本論文證實聯(lián)用PGAM1抑制劑能拓展PARP抑制劑的治療空間,為PARP抑制劑治療BRCA野生型腫瘤帶來了新契機。
[Abstract]:Abnormal energy metabolism is one of the most important characteristics of tumor cells, which mainly depends on aerobic glycolysis for energy metabolism. Aerobic glycolytic metabolic enzymes are the core elements regulating the pathway of aerobic glycolysis metabolism. The abnormal expression and activity of these enzymes are closely related to the degree of malignancy of various tumors and are the current research in the field of tumor metabolism. In fact, recent evidence suggests that metabolic enzymes may contribute to the maintenance of malignant microenvironment of tumor cells. It is of great significance to understand the role of metabolic enzymes in tumor genesis and development and their molecular mechanisms in revealing the role of tumor metabolism in the process of malignancy. It will also provide important theoretical basis for anti-tumor strategies targeting tumor metabolism. PGAM1 is an important metabolic enzyme in the aerobic glycolysis pathway. It participates in the aerobic glycolysis pathway by catalyzing the conversion of 3-phosphoglyceric acid (3-PG) to 2-phosphoglyceric acid (2-PG), and has high expression or activity in a variety of tumors. Recently, it has been reported that PGAM1 regulates pentose phosphate and serine biosynthesis pathway simultaneously through its enzyme activity. PGAM1 has become an important molecule in the field of tumor metabolism. However, the understanding of PGAM1 is still very limited, only in the aspects of energy supply and biosynthesis. The role of PGAM1 inhibitors in biological development provides experimental evidence and important information for guiding the use and development of PGAM1 inhibitors. First, we used mass spectrometry-based proteomics techniques to systematically study the possible signaling pathways that interfere with PGAM1 function. In this paper, we will explore the possible role of PGAM1 in DNA damage response. Firstly, to confirm the role of PGAM1 in DNA damage response, we examined the effects of PGAM1 interference on the sensitivity of different types of DNA damage drugs by clone formation and other experiments. It was found that PGAM1 could selectively enhance the cell sensitivity to CPT and CDDP, suggesting that PGAM1 might be closely related to the replication-dependent DNA double strand breaks (DSBs) response induced by CPT and CDDP. We found that interfering with PGAM1 did not affect the initial damage level of DSBs, but resulted in DNA repair deficiencies. Further, we revealed that PGAM1 specifically regulates HR repair, not NHEJ junction, through two major repair pathways, homologous recombination (HR) or non-homologous end-joining (NHEJ) reporter gene system. By comparing PGAM1 with wild-type or mutant PGAM1, we found that the DNA damage repair function of PGAM1 was enzyme-dependent. Meanwhile, PGMI-004A or methyl-2-PG, the enzyme activity inhibitor of PGAM1, were used to confirm the above results. The results showed that PGAM1 participated in HR repair mainly by affecting the pentose phosphate pathway. The end product of the pentose phosphate pathway, dNTP, could reverse the defect of HR repair induced by PGAM1 interference. In this study, we focused on several key steps in HR repair. Combining with immunofluorescence detection of repair protein foci formation, we found that interfering with PGAM1 affected CPT-induced single-stranded DNA (ssDNA) exposure at the end of DSBs, which hindered the recruitment of RPA complexes. In-depth study found that PGAM1 regulated intracellular dNTP levels, resulting in p53/p73-dependent p21 transcription activation, the latter by up-regulating the activity of E3 ubiquitin ligase APC/Cdh1, resulting in decreased stability of CtIP protein, protein level down-regulation. Based on the above mechanism, we explored the clinical strategy of PGAM1 inhibitor. Using subcutaneous transplantation tumor model in nude mice, we found that interfering with PGAM1 or combining with PGAM1 inhibitor could enhance the inhibitory effect of Olaparib on BRCA wild-type transplanted tumor, and interfering with PGAM1 or PGMI-004A significantly. To sum up, we have found that PGAM1 regulates the repair of HR by regulating the level of CtIP protein in tumor tissues, leading to the accumulation of DNA damage and inducing apoptosis. On this basis, this study confirmed that the combination of PGAM1 inhibitors can expand the therapeutic space of PARP inhibitors, and provide a new opportunity for PARP inhibitors to treat BRCA wild-type tumors.
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R96

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