【摘要】：研究背景阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是導致癡呆最常見的病因,然而目前尚無有效的治療方法可以阻止或者延緩疾病的進展。在探索散發(fā)性AD的發(fā)病機理的過程中,越來越多的證據(jù)表明胰島素信號通路異常在AD發(fā)病中起著非常重要的作用。因此,以胰島素信號通路為靶向治療AD得到人們越來越多的關(guān)注。經(jīng)鼻吸入胰島素已經(jīng)被證實可以改善健康受試者和AD患者的記憶和注意力,但這種保護作用的具體機制仍待闡明。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),給予AD轉(zhuǎn)基因小鼠(3×Tg-AD小鼠)經(jīng)鼻吸入胰島素1周后,可以改善胰島素信號通路異常,降低腦內(nèi)Aβ40(amyloid beta,Aβ)的含量。但經(jīng)鼻吸入胰島素是否能夠增加腦葡萄糖代謝,減輕神經(jīng)炎癥,改善突觸功能,降低tau蛋白的磷酸化水平,進而改善認知功能障礙,有待我們進一步探索和研究。側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素(intracerebroventricular streptozotocin-injected,ICV-STZ)的大鼠模型,是一種被廣泛應(yīng)用的散發(fā)性AD(sporadic AD,SAD)的模型,表現(xiàn)為認知功能障礙和許多類似AD樣的病理改變?nèi)缫葝u素抵抗,腦代謝降低,神經(jīng)炎癥和tau蛋白過度磷酸化等。為了進一步研究經(jīng)鼻吸入胰島素對散發(fā)性AD的治療作用,尤其是對認知功能、腦代謝及tau磷酸化的影響,我們采用ICV-STZ大鼠模型,連續(xù)經(jīng)鼻吸入胰島素6周(2U/天)后,檢測各組大鼠的一般情況,行為學,腦葡萄糖代謝和分子生物學指標的改變,為進一步開展后期臨床試驗提供堅實的理論依據(jù)。研究內(nèi)容和結(jié)果1.本研究中,我們將所有的大鼠隨機分成三組:正常對照組(Con),生理鹽水組(STZ/Sal)和胰島素組(STZ/Ins)。給藥過程中監(jiān)測三組大鼠的體重和血糖,發(fā)現(xiàn)三組大鼠血糖的變化無明顯差異,生理鹽水組和胰島素組體重較正常對照組明顯減輕。2.采用曠場實驗(Open Field,OF),物體識別實驗(Object Recognition test,ORT)和水迷宮測試(Morris Water Maze,MWM)來評估三組大鼠的自主活動和認知功能。曠場實驗中,ICV-STZ大鼠在曠場內(nèi)活動經(jīng)過的距離比對照組明顯增加,表明其對環(huán)境的探究行為增加,經(jīng)鼻吸入胰島素后能降低該組大鼠的探究行為。物體識別實驗中,ICV-STZ大鼠探究新物體的時間顯著少于對照組,而胰島素組與對照組之間沒有明顯差別,表明ICV-STZ大鼠短時記憶受損。在MWM的獲得性訓練(acquisition phase)中,三組大鼠的逃避潛伏期(Escape latency)和游泳速度(Swim speed)無顯著差異;而在探查測驗(probe trial)中,ICV-STZ大鼠在目標象限停留的時間和穿越原平臺的次數(shù)明顯低于對照組和胰島素組,提示胰島素能夠改善ICV-STZ大鼠的空間記憶損害。3.我們用免疫印跡法檢測了經(jīng)鼻吸入胰島素對ICV-STZ大鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化的影響。結(jié)果顯示與對照組相比,ICV-STZ大鼠腦內(nèi)tau蛋白多個位點磷酸化水平升高,如 Ser199/202,Thr205,Ser262 和 Ser396,而總 tau 蛋白(Tau-5)表達量沒有明顯變化。經(jīng)鼻吸入胰島素能夠顯著降低上述位點的磷酸化水平。Tau蛋白的磷酸化與其激酶和磷酸酶的活性有關(guān)。為了闡明胰島素降低tau過度磷酸化的機制,我們檢測了相關(guān)的激酶和磷酸酶的表達水平。我們發(fā)現(xiàn)各組大鼠腦內(nèi)tau蛋白激酶總量無明顯差異。在ICV-STZ大鼠腦內(nèi),糖原合成酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)、絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase,MAPK/ERK)、c-Jun 氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)、和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependentproteinkinaseⅡ,CaMKⅡ)的磷酸化水平明顯升高。吸入胰島素能夠?qū)SK-3、ERK1/2和CaMKⅡ的磷酸化水平降低到正常組水平。蛋白磷酸酶2(PP2A)是人腦內(nèi)最重要的tau的磷酸酶。我們沒有觀察到ICV-STZ大鼠腦內(nèi)PP2A-C蛋白水平和其活性的改變,胰島素治療對其也沒有影響。這些結(jié)果表明,經(jīng)鼻吸入胰島素降低ICV-STZ大鼠腦內(nèi)過度磷酸化的tau可能是通過下調(diào)ERK1/2和CaMKⅡ的活性實現(xiàn)的。4.為了研究胰島素對神經(jīng)炎癥的影響,我們檢測了三組大鼠腦內(nèi)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和離子鈣接頭分子-1(ionized Ca2+-binding adaptor molecule-1,Iba1)的表達水平。結(jié)果顯示,與對照組相比,ICV-STZ大鼠腦內(nèi)GFAP和Iba1水平顯著增高,而胰島素能夠明顯抑制Iba1的表達。免疫組化的結(jié)果進一步印證了以上結(jié)果。5.我們還檢測了三組大鼠海馬新生神經(jīng)元標記物doublecortin(DCX)和突觸前膜、突觸后膜相關(guān)蛋白水平的變化。結(jié)果顯示與對照組相比,ICV-STZ大鼠腦內(nèi)的DCX、突觸素(synaptophysin)、突觸蛋白1(synapsin 1)和突觸后密度蛋白-95(PSD-95)表達水平無明顯差別。但是胰島素組的DCX水平確明顯高于對照組,此外,胰島素組的synapsin 1水平高于生理鹽水組。6.為了研究經(jīng)鼻吸入胰島素對腦胰島素信號通路的影響,我們檢測了通路上相關(guān)蛋白的表達水平和活性。我們發(fā)現(xiàn)ICV-STZ大鼠腦內(nèi)IRS1和AKTpT308水平明顯升高,說明ICV-STZ大鼠腦內(nèi)存在一定的胰島素信號通路異常。吸入胰島素使ICV-STZ大鼠海馬內(nèi)升高的AKTpT308水平恢復(fù)到正常水平。7.腦葡萄糖代謝降低是AD的一個重要的病理生理特征。為了評估經(jīng)鼻吸入胰島素是否會影響ICV-STZ大鼠的腦葡萄糖代謝,我們應(yīng)用microPET檢測了大鼠腦內(nèi)~(18)F-氟脫氧葡萄糖(~(18)F-FDG)的標準化攝取值(SUVs)。結(jié)果顯示,與對照組相比,注射側(cè)ICV-STZ大鼠前額葉皮層、扣帶回、紋狀體、海馬和內(nèi)嗅皮層~(18)F-FDG SUVs明顯降低。經(jīng)鼻吸入胰島素能夠明顯增加ICV-STZ大鼠前額葉皮層和扣帶回的~(18)F-FDG SUVs。為了研究胰島素對各腦區(qū)神經(jīng)元的影響,接下來我們用免疫組化方法檢測了神經(jīng)元標記物—NeuN在各腦區(qū)的表達。結(jié)果顯示ICV-STZ大鼠海馬的CA1、CA3區(qū)和紋狀體的陽性細胞數(shù)較對照組顯著減少。經(jīng)鼻吸入胰島素增加了 ICV-STZ大鼠海馬的CA1、CA3區(qū)的NeuN陽性細胞數(shù),提示胰島素可以阻止ICV-STZ大鼠海馬內(nèi)的神經(jīng)元丟失。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)ICV-STZ大鼠存在認知功能障礙,tau過度磷酸化,神經(jīng)炎癥。此外,我們還發(fā)現(xiàn)注射側(cè)ICV-STZ大鼠前額葉皮層、扣帶回、紋狀體、海馬和內(nèi)嗅皮層葡萄糖代謝顯著降低。經(jīng)鼻吸入胰島素6周可以明顯改善ICV-STZ大鼠的認知功能,減輕腦內(nèi)tau蛋白的過度磷酸化和小膠質(zhì)細胞激活,增加海馬內(nèi)新生神經(jīng)元生成;吸入胰島素還顯著改善了 ICV-STZ大鼠前額葉皮層和扣帶回的葡萄糖代謝,防止海馬神經(jīng)元丟失。
[Abstract]:In order to study the effect of insulin signal pathway on the pathogenesis of sporadic AD , more and more attention has been paid to the treatment of sporadic AD . There was no significant difference in phosphorylation of tau protein in the brain of ICV - induced diabetic rats than that in control group . The results showed that the phosphorylation of tau protein in ICV - induced diabetic rats was significantly lower than that in control group . In order to study the effect of insulin on the brain glucose metabolism in ICV - induced diabetic rats , the levels and activity of the related protein in the brain of ICV - induced diabetic rats were significantly higher than those in the control group . and the hippocampal neurons are prevented from being lost .
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R749.16;R-332

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