本文選題：Paget骨病 + 基因突變�。� 參考：《山東大學》2017年博士論文

【摘要】：Paget骨病(Paget'sdiseaseofbone,PDB)是一種慢性代謝性骨疾病,由異常的溶骨性病變繼發(fā)過度的成骨性硬化而導致,常累及骨骼系統(tǒng)中的任意單個或者多個部位。PDB發(fā)病率具有顯著地域差異,其在歐美一些西方國家發(fā)病率較高,是僅次于骨質(zhì)疏松的第二大代謝性骨病。然而在非洲和亞洲國家PDB卻較為罕見,其中我國自上世紀八十年代起已報道的PDB病例僅有約200余例。PDB臨床癥狀常不典型,病情輕重不一。約22%的PDB患者無任何臨床表現(xiàn),僅僅在進行骨骼放射性檢查時偶然檢出患有Paget骨病。PDB常見的臨床表現(xiàn)主要包括骨痛以及骨骼畸形,并可能伴隨一系列的并發(fā)癥,包括椎管狹窄、耳鳴、耳聾、視力下降等神經(jīng)壓迫癥狀、繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎以及骨折等,極少數(shù)患者會出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥一骨肉瘤。破骨細胞異常活化是PDB主要的病理改變。病理檢查可見患者受累骨骼處的破骨細胞數(shù)量增多,體積增大且含有較多胞核。PDB患者外周血單核細胞對破骨細胞誘導因子的敏感性增高,使得破骨細胞分化增多。PDB病理發(fā)展過程可大體分為三個時期:首先,破骨細胞異常活化導致溶骨增加,形成早期的溶骨期;第二,溶骨性病變繼發(fā)成骨細胞活化,形成過度溶骨與成骨紊亂混合存在的混合期;最后,過度而無序的代償性成骨增多形成骨硬化期。三期改變依次發(fā)生,最終導致患者骨骼結(jié)構(gòu)紊亂、膨大畸形。PDB具體的發(fā)病原因至今仍不清楚,一般認為遺傳因素和環(huán)境因素在PDB發(fā)病過程中均發(fā)揮重要作用。以往有研究認為,在PDB溶骨性病變部位的破骨細胞內(nèi)存在麻疹病毒、呼吸道合胞病毒感染所形成的病毒小體,從而支持病毒感染導致PDB發(fā)病的結(jié)論。然而,關(guān)于這一類病毒小體的特異性仍存在較多爭論,有研究者證實在遺傳性草酸過多癥和骨硬化癥患者體內(nèi)的破骨細胞中同樣能檢出這種病毒小體,同時許多研究者表示未能在PDB患者體內(nèi)的破骨細胞中發(fā)現(xiàn)病毒感染的證據(jù),提示病毒感染導致PDB發(fā)病的結(jié)論仍存有異議。遺傳因素在PDB發(fā)病過程中具有重要的致病作用,迄今為止,通過全基因組關(guān)聯(lián)分析以及候選位點關(guān)聯(lián)分析,已經(jīng)確認了 7個PDB易感基因位點(PDB1-7),提示PDB發(fā)病具有典型的遺傳異質(zhì)性。位于PDB3(5q35)的SQSTM1基因是目前唯一確認的PDB致病基因。流行病學研究表明約10-50%的家族性PDB患者以及5-30%散發(fā)性PDB患者存在SQSTM1基因突變。另外,TNFRSF11A、TNFRSF11B以及VCP基因,因其所編碼的蛋白在破骨細胞分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用,以及他們在一些PDB相關(guān)疾病中的致病作用,也被列為PDB候選致病基因而廣泛關(guān)注。其中,位于TNFRSF11A基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP):rs1805034與PDB易感性相關(guān),但尚無證據(jù)能夠證實該SNP是PDB的致病基因多態(tài)性。TNFRSF11B基因突變與早發(fā)性PDB(juvenile PDB)患者發(fā)病相關(guān),VCP基因突變報道見于包涵體肌病伴Paget骨病和額顳葉癡呆,但在PDB患者中尚沒有關(guān)于這兩個基因突變的報道。本研究當中,我們報道了一個來自中國漢族人群的PDB家系,并對該家系中可能存在的PDB致病基因突變及其致病機制進行了深入的研究。課題從PDB致病基因檢測、功能驗證和機制研究三個方面,系統(tǒng)的證實了一個位于FKBP5基因的c.163GC突變是PDB的致病基因突變。通過本文的論述,我們旨在提高該罕見疾病在國內(nèi)的認知度,減少PDB在國內(nèi)的漏診誤診率;探索該疾病的致病基因及其致病機制,為PDB病因?qū)W的研究提供數(shù)據(jù)支持以及新的研究方向。第一部分Paget骨病家系基因突變檢測分析目的報道一例漢族家族性Paget骨病,并對該家系成員進行基因突變檢測分析,尋找PDB相關(guān)基因突變。方法1.Paget骨病診斷根據(jù)患者典型的影像學檢查結(jié)果、血清學檢查結(jié)果及臨床表現(xiàn),診斷并報道一例家族性Paget骨病。2.PDB已知致病及相關(guān)基因測序分析對家系成員DNA樣本進行已知PDB易感基因(SQSTM1、TNFRSF11A)外顯子測序分析,尋找基因突變。3.外顯子組測序分析對家系中三位PDB患者的DNA樣本,以及患者的兩位同胞兄妹的DNA樣本,進行全外顯子組測序分析(whole-exome sequencing,WES),并對WES分析得到的所有單核苷酸改變(Single Nucleotjde Variants,SNVs)按照下列條件篩選出與疾病共分離的基因突變:1.不存在于已知的單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(dbSNP)中;2.同時存在于三位患者的基因組內(nèi);3.不存在于兩位正常對照成員的基因組內(nèi);4.位于基因編碼區(qū);5.引起基因編碼錯誤。4.候選基因分析在Exome Aggregation Consortium(ExAC)數(shù)據(jù)庫中查找,排除已知基因突變。通過運用PolyPhen-2軟件預測突變功能,選取預測結(jié)果顯示突變對蛋白功能有害的基因突變。綜合以上分析結(jié)果,選擇候選基因突變。5.FKBP5基因突變測序驗證采用Sanger測序法,對所有家系成員以及200例正常對照的FKBP5第4外顯子(FKBP5基因c.163GC突變所在位點)進行測序分析。從而驗證該突變在家系中的分布情況以及驗證該突變是否為未經(jīng)報道的SNP。結(jié)果1.Paget骨病家系臨床資料本研究報道了一例發(fā)生于中國漢族人群的典型的家族性Paget骨病。家系中現(xiàn)存3名Paget骨病患者�；颊呤芾酃趋繶射線檢查結(jié)果符合典型的Paget骨病改變,包括骨皮質(zhì)膨大增厚、骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂、受累顱骨呈現(xiàn)棉絮樣改變等;病變累及部位主要包括:顱骨、椎骨及骨盆;患者臨床表現(xiàn)主要包括骨痛、脊柱畸形、頸椎及四肢乏力、身高縮短及病理性髕骨骨折等;血清學檢查結(jié)果顯示患者堿性磷酸酶(ALP)活性顯著升高。在疾病得到診斷(2011)到患者接受藥物治療(2014)的三年中,家系中三名患者病情及血清ALP水平隨時間增加而進行性加重。2014年,患者接受密固達靜脈注射治療后病情得到有效控制。2.該PDB家系中未檢測到SQSTM1及TNFRSF11A基因突變除多個SNP位點外,在患者及其他家系成員中,未檢測到SQSTM1及TNFRSF11A基因突變。提示可能存在新的基因突變參與PDB發(fā)病。3.外顯子測序分析結(jié)果顯示一個新的FKBP5基因突變與PDB發(fā)病相關(guān)外顯子組測序分析結(jié)果顯示5個位于不同基因的錯意單核苷酸突變,包括:FKBP5(c.163GC)、ACBD4(c.4GT)、MYO7B(c.772AT)、AKNA(c.4196AG)、CCL4L1(c.197GC)可能與PDB發(fā)病相關(guān)。其中位于ACBD4、MYO7B及CCL4L1的基因突變在ExAC數(shù)據(jù)庫中已有報道,而位于FKBP5以及AKNA基因的突變在ExAC數(shù)據(jù)庫中未見報道。PolyPhen-2預測結(jié)果顯示FKBP5(c.163GC)基因突變極有可能損害蛋白功能(possible pathogenicity score:0.992),而AKNA(c.4196AG)基因突變極有可能為良性突變,不影響蛋白功能(possible pathogenicity score:0.080)。另外,FKBP5基因位于一個已知的PDB易感位點(PDB1)內(nèi),且根據(jù)以往文獻的報道FKBK5編碼的FKBP5蛋白在兩條破骨細胞分化發(fā)育相關(guān)的信號通路:NF-κ B以及AKT信號通路中具有重要的調(diào)節(jié)作用。因此,確認該FKBP5基因突變可能與PDB發(fā)病相關(guān),并選擇該突變?yōu)镻DB候選致病基因突變。4.FKBP5突變驗證測序結(jié)果確認家系中所有患者的FKBP5基因均存在c.163GC點突變,表型為GC雜合子。家系中有5位患者的后代(Ⅲ3,Ⅲ13,Ⅲ15,Ⅲ17,Ⅳ2)攜帶有該基因突變。同時,在200例對照人群中未檢出該基因突變,證實該基因變異是一個新發(fā)現(xiàn)的單核苷酸突變而非未經(jīng)報道過的SNP。結(jié)論本研究報道了一例發(fā)生在中國漢族人群中的罕見家族性Paget's骨病。通過對家系成員進行基因檢測分析,確認該家系中不存在已知的PDB易感基因突變。外顯子組測序分析確認一個新的位于FKBKP5基因的c.163GC突變?yōu)镻DB候選致病基因突變。第二部分FKBP5V55L對NF-κ B和Akt信號通路的影響目的預測突變體FKBP5V551三維結(jié)構(gòu),并通過細胞實驗比較野生型和突變型FKBP5在NF-κ B以及Akt信號通路中的調(diào)節(jié)作用。方法1.FKBP5V55L突變體結(jié)構(gòu)預測使用Pymol軟件對FKBP5V55L突變體蛋白三維結(jié)構(gòu)進行預測。2.NF-κB信號通路研究a.將構(gòu)建有野生型及突變型FKBP cDNA的真核細胞表達質(zhì)粒及空載對照質(zhì)粒(pcDNA3.1-FKBP5(V55)、pcDNa3.1-FKBP5(L55)、pcDNA3.1)、PGL4.32[luc2p/NF-κ B-RE/Hygro]質(zhì)粒以及 PRL-TK 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293細胞內(nèi),通過檢測各轉(zhuǎn)染組細胞的熒光素酶活性(luciferase assay)反應 NF-κ B 的轉(zhuǎn)錄啟動活性。b.將pcDNA3.1-FKBP5(V55)、pcDNA3.1-FKBP5(L55)、pcDNA3.1 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到 HEK293 細胞內(nèi),通過 western blotting檢測各轉(zhuǎn)染組細胞活化前后胞核與胞質(zhì)蛋白中p65的量以及胞質(zhì)蛋白中IκB的量,反應NF-κ B核轉(zhuǎn)位水平。3.Akt磷酸化水平檢測將pcDNA3.1-FKBP5(V55)、pcDNA3.1-FKBP5(L55)、pcDNA3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HEK293細胞內(nèi),轉(zhuǎn)染后的細胞經(jīng)血清饑餓后用脂多糖(LPS)刺激活化。提取活化的細胞的總蛋白,經(jīng)蛋白免疫印跡實驗(western blotting)檢測細胞內(nèi)Akt Seer473位點磷酸化水平,研究野生型及突變型FKBP5對Akt磷酸化的調(diào)節(jié)作用有無差異。4.Akt激酶活性檢測將構(gòu)建有野生型和突變型FKBP5的慢病毒載體(LV-FKBP5(V55)/EGFP、LV-FKBP5(L55)/EGFP)分別轉(zhuǎn)染到U937細胞內(nèi),建立表達野生型及突變型FKBP5的單克隆U937細胞系。將兩組細胞分別接種到六孔板內(nèi),經(jīng)過兩小時血清饑餓后,加10%FBS活化細胞。提取兩組細胞的總蛋白,使用Akt激酶活性檢測試劑盒檢測兩組總蛋白中Akt激酶的活性。結(jié)果1.FKBP5V55L突變體結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示,V55L氨基酸改變位于FKBP5 N末端第一個β折疊內(nèi),FK1結(jié)構(gòu)域的表面。亮氨酸疏水側(cè)鏈較纈氨酸更為突出,可能使得突變所在位點的空間位阻增大,從而影響該結(jié)構(gòu)域與底物的結(jié)合能力。2.V55L突變不影響FKBP5對NF-κB信號通路活化的調(diào)控作用熒光素酶活性實驗證實野生型及突變型FKBP5轉(zhuǎn)染組細胞之間,相對熒光素酶活性(relative luciferase activity)沒有顯著差異,p=0.3624。同時,western blotting結(jié)果顯示野生組與突變組HEK293細胞活化后,其胞內(nèi)IκB降解以及p65核轉(zhuǎn)位水平均無明顯差異。說明該V55L突變不影響FKBP5對NF-κ B信號活化的調(diào)控作用。3.FKBP5V55L突變增加AktSer473位點磷酸化水平突變型FKBP5過表達的HEK293細胞在經(jīng)過活化后,其Akt Ser473位點磷酸化水平高于野生型FKBP5過表達的HEK293細胞的AktSer473磷酸水平;條帶灰度值分析證實,突變組pAkt(Ser473)/Akt比例高于野生組,p=0.0075。證明該V55L突變影響FKBP5蛋白對Akt磷酸化的調(diào)節(jié)作用,與野生型FKBP5相比突變的FKBP5能夠增加Akt磷酸化水平。4.FKBP5 V55L突變增加Akt激酶活性Akt激酶活性檢測發(fā)現(xiàn),與野生型FKBP5相比突變型FKBP5能夠增加Akt激酶對GSK-3 a的磷酸化作用。證實該突變能夠增加Akt激酶活性。結(jié)論FKBP5V55L突變不影響FKBP5蛋白對NF-κ B活化及核轉(zhuǎn)位的調(diào)控作用。FKBP5V55L突變體蛋白能夠增加Akt磷酸化水平,提高Akt激酶活性。第三部分FKBP5V55 C57BL/6小鼠破骨細胞活性及表型研究目的驗證FKBP5V55L突變體蛋白對破骨細胞分化及破骨吸收活性的影響,并對其機制進行研究。探索FKBP5V55L點突變轉(zhuǎn)基因小鼠paget骨病表型。方法1.FKBP5V55L及FKBP5WT小鼠繁育及鑒定本實驗中V55L+-F1代雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠購自賽業(yè)生物科技有限公司。實驗小鼠飼養(yǎng)嚴格按照《實驗動物管理條例》、《山東省實施實驗動物管理條例辦法》的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級,使用V55L'-雜合子小鼠作為親代繁育子代同窩小鼠。子代小鼠鑒定:剪取小鼠尾尖組織,用50nM NaOH溶液裂解后作為DNA模板。使用PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳以及sanger測序法驗證子代小鼠基因型,并用于后續(xù)實驗。2.破骨細胞分化分離培養(yǎng)FKBP5V55L小鼠及同窩FKBP5WT野生鼠骨髓來源的單核/巨噬細胞系細胞(bone marrow-derived monocyte/macrophage ccells,BMMs),經(jīng) M-CSF因子(30ng/ml)及不同濃度的 RANKL 因子(0、30ng/ml、70ng/ml、150ng/ml)誘導分化3天后,通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)鑒定并計數(shù)破骨細胞。鑒定方法:胞核≥3個,TRAP染色陽性的多核巨細胞為破骨細胞。3.陷窩吸收實驗分離培養(yǎng)FKBP5V55L小鼠及同窩FKBP5WT野生鼠BMMs,并接種在牛骨切片上。經(jīng)M-CSF(30ng/ml)、RANKL(100ng/ml)誘導分化7天后,超聲裂解切片上的細胞并用1%甲苯胺藍染色。在顯微鏡下拍照并計算每個視野中吸收陷窩的面積。4.實時定量PCR檢測破骨細胞相關(guān)分子表達FKBP5V55L小鼠及同窩FKBP5WT野生鼠BMMs,經(jīng)RANKL(100ng/ml)誘導0、1、2、3天后,提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過實時定量PCR檢測破骨細胞相關(guān)分子NFATC1、TRAP及OSCAR表達水平。5.western blotting FKBP5V55L 小鼠及同窩 FKBP5WT 野生鼠 BMMs,經(jīng)M-CSF(30ng/ml)、RANKL(100ng/ml)誘導 0、]、2、3 天后,提取總蛋白,經(jīng) western blotting檢測NFATC1、c-fos及LC3表達。FKBP5V55L小鼠及同窩FKBP5WT野生鼠BMMs,經(jīng) M-CSF(30ng/ml)、RANKL(100ng/m;)誘導分化 3 天后,血清饑餓 4 小時。加RANKL因子活化細胞0、5、10、30分鐘,立即提取細胞總蛋白。經(jīng)western blot檢測Akt磷酸化、Erk磷酸化以及IKB表達水平。6.小鼠股骨Micro-CT取10個月大FKBP5V55L小鼠及同窩FKBP5WT野生鼠股骨及脛骨并固定。固定后的標本使用西門子Inveon micro-CT檢測儀掃描。掃描結(jié)果使用儀器自帶Inveon Acquisition Workplace 和 Inveon Research Workplace 平臺進行成像及骨吸收參數(shù)分析。結(jié)果1.FKBP5V55L及FKBP5WT小鼠繁育及鑒定本實驗中V55L+-雜合子小鼠生育能力正常。經(jīng)PCR瓊脂糖凝膠電泳鑒定及sanger測序分析,證實子代小鼠中FKBP5V55L、FKBP5WT及雜合小鼠出生比例基本符合孟德爾遺傳規(guī)律。選擇同窩小鼠中的FKBP5V55L及FKBP5WT小鼠作為實驗及對照小鼠用于后續(xù)研究。2.FKBP5V55L小鼠來源的祖細胞破骨細胞分化能力增強小鼠破骨細胞體外分化及TRAP染色結(jié)果顯示,野生組與突變組小鼠BMMs在MCSF/RANKL誘導3天后,分別開始分化為破骨細胞,且形成的破骨細胞數(shù)目隨RANKL濃度增高而增加。在相同濃度的RANKL因子誘導下(70ng/ml、150ng/ml),平均每個低倍視野下(40×)突變組小鼠BMMs形成的破骨細胞數(shù)目明顯多于野生小鼠(70ng/ml:FKBP5WT VS FKBP5V55L:42.7±7.6 VS 72.2±13.2,p=0.0284;150ng/ml:FKBP5WT VS FKBP5V55L:55.7±22.1 VS 130.3±23.5,p=0.0162)。3.FKBP5V55L小鼠來源的破骨細胞骨吸收活性增高陷窩吸收實驗結(jié)果顯示每高倍視野下(100×)FKBP5V55L小鼠來源的破骨細胞形成的陷窩面積顯著大于對照小鼠來源的破骨細胞(FKBP5 VS FKBP5V55L:4.73±1.02 mm2 VS 8.29±0.66 mm2;p=0.0071)。4.FKBP5V55L小鼠骨髓單核/巨噬細胞 NFATC1、TRAP及OSCAR表達高于野生小鼠實時定量PCR結(jié)果顯示野生及突變小鼠BMMs在RANKL誘導下,轉(zhuǎn)錄因子NFATC;及破骨細胞相關(guān)分子TRAP、OSCAR表達量均顯著增高。并且在RANKL誘導時間相同的條件下,FKBP5V55L小鼠BMMs的NFATC1、TRAP及OSCAR表達水平顯著高于野生小鼠。同時,Western blotting結(jié)果顯示FKBP5V55L小鼠BMMs的NFATC1轉(zhuǎn)錄因子表達水平高于野生小鼠,而兩組細胞之間c-fos表達量無明顯差異。5.FKBP5V55L鼠骨髓單核/巨噬細胞Akt磷酸化水平增高FKBP5V55L小鼠來源的BMMs經(jīng)RANKL因子活化后,其胞內(nèi)Akt磷酸化水平高于對照組小鼠BMMs的Akt磷酸化水平;同時,兩組細胞之間Erk磷酸化及IκB降解水平無明顯差異。說明FKBP5V55L可能通過調(diào)控Akt磷酸化水平影響破骨細胞分化及參與PDB發(fā)病。6.FKBP5V55L小鼠表現(xiàn)出部分PDB表型小鼠股骨近端Micro-CT骨參數(shù)分析結(jié)果顯示,與野生小鼠相比FKBP5V55L鼠股骨:相對骨體積(Bone volum/Total volum,BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Trabecular Number,Tb.N)、骨小梁厚度(Trabecu;ar Thinckness,Tb.Th)減少;而骨小梁分離度(Trabecular Spacing,Tb.Sp)、骨小梁模式因子(Trabecular Bone Pattern factor,TBPf)增加。FKBP5V55L小鼠呈現(xiàn)出明顯的小梁骨過度吸收表現(xiàn),與體外實驗發(fā)現(xiàn)的破骨細胞分化及骨吸收能力增加相對應。然而,FKBP5V55L小鼠Mi cro-CT檢測未見異常的骨皮質(zhì)增厚及擴張表現(xiàn)。股骨遠端及脛骨近端部位3D骨重建結(jié)果顯示,三只FKBP5V55L小鼠中有兩只小鼠的股骨遠端骨皮質(zhì)出現(xiàn)可疑的骨吸收陷窩,而三只FKBP5WT小鼠中未見該改變。提示FKBP5V55L鼠體內(nèi)存在溶骨增加性病理改變,部分符合PDB表型。結(jié)論FKBP5V55L突變增加小鼠體外破骨細胞分化及骨吸收能力。FKBP5V55L突變主要通過增加Akt/NFATC1信號通路來調(diào)控破骨細胞分化能力。FKBP5V55L突變增加小鼠體內(nèi)破骨細胞數(shù)量,能夠?qū)е滦∈蠊趋莱霈F(xiàn)PDB樣溶骨性病理改變。提示本研究所報道的FKBP5 c.163GC基因突變(FKBP5V55L)能夠通過增加破骨細胞分化及增加破骨細胞活性從而導致PDB發(fā)生。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R681

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 孫亞方;王銀昌;王來城;焦玉蓮;崔彬;夏羽;盧冰如;趙躍然;;一個Paget骨病家系SQSTM1及TNFRSF11A基因突變分析[J];山東大學學報(醫(yī)學版);2012年12期

，

本文編號：2086023